Способ приготовления иммунофлюоресцентных

 

О П И С А Н И Е 37О497

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистически

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Зависимое от авт. свидетельства ¹

Заявлено 20, I V.1971 (№ 1652769!31-16) с присоединением заявки №

Приоритет

Опубликовано 15.11.1973. Бюллетень ¹ 11

Дата опубликования описания 23.IV.1973

М. Кл. G 01п 1 30

Комитет по аслам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 51 9.449.57:614.48 (088.8) Авторы изобретения

Заявитель

В. Я. Кармышева, Л. М. Фарутина и Л. Н. Cjyuim

Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов

Академии медицинских наук СССР

СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫХ

ПРЕПАРАТОВ

Изобретение относится к области медицины.

Известен способ приготовления иммунофлюоресцентных препаратов, заключающийся в том, что в исследуемые объекты вводят радиоактивную метку с последующей фиксацией в ацетоне, промывкой, очисткой от радиоактивных примесей, сушкой, нанесением на препарат иммунной сыворотки, исследованием препарата в люминесцентном микроскопе, определением локализации и количества антигенов с последующим покрытием препарата светочувствительной фотопленкой и выявлением химических компонентов, известными и применяемыми при радиоавтографических методах «сследования.

Однако этот способ не позволяет одновременно исследовать локализацию и количество антигенов и химических компонентов в одной и той же структуре.

В предлагаемом способе в отличие от известных фиксацию объекта проводят в спиртуксусной кислоте с последующим нанесением светочувствительной эмульсии в концентрации

1: 2, выдерживании с ней препарата и нанесением иммунной сыворотки после проявления и обработки на 60 мин при 37 С.

Пример. В качестве модели используют перевиваемые культуры клеток почек сирийского хомяка, выращенные на покровных стеклах и зараженные вирусами Астра и Ибадан.

Через трое суток после заражения в культуральную жидкость добавляют предшественник

РНК уридин И в дозе 5цС на 1 мл на 24 «ас.

Через 24 час культуры отмывают от среды

5 физиологическим раствором и фиксируют смесью спирт-уксусной кислоты (3: 1) в течение 15 — 20 мин, затем промывают в 70-градусном спирте 5 иин и помещают в 3 / -ную хлорную кислоту на 20 мин при 4 "С. 11осле

10 этого препараты отмывают в проточной воде и нескольких порциях дистиллированной воды

40 мин и сушат.

Покровные стекла наклеивают канадским бальзамом на предметные стекла культурой

15 вверх. Необходимость в этом отпадает прп выращивании культуры на предметных стекла.;.

Препараты покрывают тонким слоем разведенной 1: 2 светочувствительной эмульсией типа М при 42 С (светофильтр желто-зеленый

20 117 или 118) и помещают в герметпзпровапные лейкопластырем светонепроницаемые ящики в холодильник при 4 С на 5 суток до появления нужного количества зерен серебра.

Затем препараты проявляют в ампдоловом

25 проявителе для авторадиографип 2,5 л1ин прп

18 С, промывают 1 мин дистиллированно" ";одой, фиксируют 30с с-ным раствором гппосульфита 10 мин, промывают в проточной воде

60 мин и споласкивают в дистиллированной

30 воде. На препараты, помещенные в влажные

370497

Предмет изобретения

Составитель С. Щенева

Техред 3, Тараненко Корректор А. Степанова

Редактор Т. Illaraeaa

Заказ 1087/1 Изд. № 364 Тираж 755 Подписно е

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий прн Совете Министров СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 камеры, наносят меченую изотиоцианатом флюоресцеина иммунную сыворотку па 40— бО нин прп 37 С, после чего препараты промывают в нескольких порциях забуференного физиологического раствора (рН 7,2 — 7,4) в течение 15 — 20 иин, споласкивают дистиллированной водой и подсушивают.

Лезвием бритвы осторожно отделяют препарат — покровное стекло, протирают нижнюю часть ксилолом или бензолом для удаления бальзама и осторожно небольшой каплей бальзама (или подходящего клея) подклеивают с одного края препарат на чистое предметное стекло, чтобы бальзам не растекся, так как он сильно флюоресцирует. Необходимость в этом отпадает при выращивании культур на предметных стеклах.

Препараты просматривают в люминесцентном микроскопе без покровных стекол, не заключая в забуференный глицерин. Места синтеза РНК учитывают по черным зернам серебра, которые можно подсчитать, меняя глубину фокуса микровинтом.

Места локализации антигена в ядрах и цитоплазме клеток на том же препарате учитывают по яркой зеленой флюоресценции. Прп предлагаемом способе иммунофлюоресценцпя не нарушается ни слоем фотоэмульсии, ни скоплениями зерен серебра.

Способ приготовления иммунофлюорес11ентных препаратов путем введения в исследуемые

10 объекты радиоактивной метки с последующей фиксацией, промывкой, покрытием светочувствительным материалом, очисткой от радиоактивных примесей, проявлением сушкой с последующим нанесением сыворотки для иссле15 дования в люминесцентном микроскопе, от1ичающийся тем, что, с целью одновременного исследования локализации и количества в одной и той же структуре антигенов и химических компонентов, фиксацию объекта прово20 дят в спирт-уксусной кислоте с последующим нанесением светочувствительной эмульсии в концентрации 1: 2, выдерживании с Йей препарата и нанесейием иммунной сыворотки после проявления и обраоотки на 60 мин при

25 37 С.