Патент ссср 398603
398603
Союз Советских
Социалистических
Ресттублик
ОП ИСАНИ Е
И ЗОБРЕТЕ.Н Ия
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Зависимое от авт. свидетельства —— (22) Зяявле»о 27.05.71 (21) 1663909/28-13 с пр1исоеди не» и см заявки ¹â€” (32) Пр»оритст-Опi бликова»о 27.09.73. Ьюллете»ь М 38 (О! ) 41. Кл. С 12d 13/10
Государственный комитет
Совета Министров СССР
Iia делам изобретений
M открытий (5 эъ) УДК 663.14 (088.8) Дата опубликовашгя о»»сания 23.12.74 (72) Авторы изобрете»ия
P. В. Фениксова, А. С. Тихомирова, Н. А. Загустина, А. К. Куликова и Г. Г. Тронина
Ордена Ленина институт биохимии им. А. H. Баха (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА
Р-ГАЛАКТОЗ ИДАЗЫ
Соевая мука
Лимонная кислота (iU F14) gS0.1
iX ае НР04
XgSO4
КС! при рН равном 2,0 — -6,0.
10 — 50
5 — 30
1 — 5
2 — -20
0,1-0,5
0,1 — 1,0
Изобретение о Tíoñèòeÿ к мик робиологи 1еокой промышленности, точнее к протсз водству ферментных препаратов из культур микроорганизмо в, в частно|сти к способам получения ферментного препа.рата Р-галактозидазы.
Известен способ получения ферментного препарата 13-гялакгозидазы путем выращивания на питательной среде пртндуци1рующих ее плесневых грибов в глубинных условиях.
Для повышения активности р-галактозидазы предлагается в качест1ве продуцирующих микроорганизмов попользовать род Alternaria. Из рода Alternaria может быть иапользован вид
ten»is, а из вида tenuis — штамм 123. Данные микроорганизмы можно выращивать на питательной среде в присутствии соевой муки, лимонной кислоты и необходимых минеральных солей при рН ее равном 2,0 — 6,0.
В качестве продуцента Р-галактозидазы предлагается плесневый гриб Alternaria tenuis, выращиваемый па среде следующего состава, г/.1:
Эта среда обеспеч,ивает более высоки11 уровень биосинтеза j3-галактозидазы, на биосинтез особенно влияет начальная величина рН среды. Пр» культивпро1ванип на данной:среде этого гриба 98% р-галактозпдазы переходит в к .7ьту рну10 жидкость) ITQ нябл10дяетс17 только на среде указанного состава и значительно облег1ает дальнейшее выделение препарата (3-галактозндазы. При добавлении в данную среду 2 — 10% галактозы образование фермента увеличивается на 20 — 30%. Оптимум рН р-галактозидазы данного продуцента равен
4,2; при рН 5 coxpaняется 80% активности, при рН 5,4 — 70% активности. Это имеет значение для применения фермента в хлебопечеппп, так как pH теста o.IIIsDI,II 5. (3-ГЯлЯктОз1тдЯзЯ,IIieIl0Ib32 ется для гидрол11за лакгозы моло нных продуктов до глюкозы II лактозы.
20 Прп гидролизе слаборастворнмый, несладк»Й> несбраживяемыЙ xлебопекяр нт тxti1 дрожжами, иногда не усваивающяйся ж1пвотным организмом дисахарид — лактоза,превращается B растворимую, более сладкую, сбражива25 емую, тевыиваlогц юся смесь моыосяхядт1дов.
На этом основано практическое при1менение
Р-галактозидазы Iia различных продуцептов в хлебопеченип, в кондитерской промышленности, в Тех отраслях пищевой промышленностч1, 30 которые сгязаны с угплизацией побо1ных про398603
1
0,5
0,5
NH4NOç
К,НРО4
Мо 804 7Н О
КСl прп рН равном 4,1 — 4,3.
3 — 10 лл
10 — 50
1 — 10
0,1 — 1,0
0,1 — 1,0
0,1 в 1,0
К у1иурузны11 экспракт
Лакт1оза
N 1 4NOa
Na2HPOI
MgSO
КС1
15
С реда № 1
10 — 50
5 — 30
1 — 5
2 — 20
0,1 — 0,5
0,1 — 1,0
Соевая мука
Лимонная иислота (ХН,),804
Na2HPO4
MgSO4
КС1 при рН равном 2,0 — 6,0.
ЗО
3--10 л.1
50 — 10
1 — 10
0,1 — 1,0
0,1 в 1,0
0,1 — 1,0
Кукурузный экстракт
Лактоза
Ь Н41 О
Na FIP0»
MgSO., КС1
¹ 3 (синтетическая) 15,00
2,00
13,60
0,15
0,50
Среда
Лактоза (NH4) SO4
КН РО4
MgSO4
КС1 рН=4,6.
10 лл
30 г 65 дуктов переработки молока и с кон1серви1рованием молока, t живот1но водстве, в ветери нарии
Н B МЕДИ1ЦИНЕ.
П1римеры культивирования Alternaria te1lu1s — 1про дуцелта р-,ãàëàêòoçIItäàçû. 5
Посе впь1м материалом служит 7-суточная культура грибс1в, выращенная при 28 С на ага ризован1ной среде следующего состава, г/л: прп рН ра вном 5,0 — 8,0.
Дальнейшее глубиын ое культивирование гриба произвсдипся в течение 2 — 5 суток пр41
28 С па средах следующего состава, г/л; 20
Мицелпй отделяется от иультуральиой жидкости. На 1 л кульгуралыной жидкости п1ри культи вир св а н71и Al terna r i a н а ка пли в а етс11 до
2000 c;I:1зни р-галактозидазы. В к1ультураль,ну1о жидксст1 переходит до 98% всего 1синтезировапного фермента.
Активность Р-галактозидазы определяется коло1риметрическп по 1появле нию окрашен-II!x молекул ортонитрофенола, оавобождающего ся под дейспвнем фермента из бесцветного ортонитро-фенил+Р-галактопиранозида при рН рав11о.м 4,2.
Среда №2
В среду № 1 добавляют 2 — 10 г/л галактозы,,при этом 1выхо1д фер1мента увеличивается на 20 30О/о, по арав нению со средой М 1.
Выход р-галактози дазы для Alternaria—
160 еди1ниц на 1 л куль71у ральной ж1идко сти и
40 единиц остает ся в мицелии, выросшем в 60
1 л ре.7 !.
Среда №4
Кукурузный экстракт
Лактоза
Выход р-галактозидазы для Alternaria на
1 л культуральной жидко апи 500 единиц и
600 еди.ниц остаетая в,мицелии.
Кульпурально-морфологическая характерист1ика Alternalia tenuis на 10 сутки роста.
Гриб о пнесен к роду Alternaria порядка
Moniliales cåìåIIcòâó Demantiaceac.
На 1синтетической среде Ча1пека с сахарозой и NBNOq колошении диамет1ром 70 — 80 л1з1 с
pa)BIlIIol краем, зональность слабо выражена, серые .к центру оливково-серые, с выпуклой центральной частью. Воздушный мнцелий от белого до оливково- серого, войлочпсвидный, спсрообра|зование скудное. Обратная сторона колоний бурова цвета. Пигмента нет.
На сусло-ага ре (сусло 5 ло Баллингу) колонии диаметром 70 — 80 лл с,равным 11 краями, выпуклые, круглые, с ровной 1поверхностью.
Воздушный ми цели11 обильный, белый, ватообразный. Обра1гная сторона колоний бурая.
Пигмента пет.
Ha cpczc c Io I<) p3 sI4hIill экстрактом 11 7aic!03 он г/л:
Колонии диаметром 70 — 80 лл с равным краем, оируглые, выпуклые, зс1нальность слабо выражена. Воздуш1ный:мицелий аначала белый,,войлочнов1идный, зaTe!M,серо1ватый, обильный. Обратная CTopcна ко.7 оний бурая. Пигмента нет.
Alternaria tenuis характерк4зуется нали1ием спор, образующих мало раз ветв7е1нные,цепочки. Верхушечная спора образует, как правило, одну единственную спору. Содержание мелких шаро видных апор на конце це почки от 20 до
40%. Alternaria tenuis образует споры,кс ричневые, гладкие или бородавчатые с простыми носиками и сравнительно небольшими размерами. Споры состоят обычно нз довольно ограни1аннопо ио,7пчества клето1к, разделение продо71!IoII перегородки зачастую сокращается до 1 — 2, поперечной — до 3 — 5. Altcrnaria tenuis — сс1профит, имеющий патогенность, сравнимую с патогеипосчью А. chartarum f. stcmplIylium и более высокую, чем А. consortiale H
А.,chartarum. А1(егпапа tenuis находят на листьях, плодах и корнях большого количества растений. Размеры спор колеблются в завиаимости от оубстрата нли растения-хозя Iaa и лежат н пределах 24 — 23 — 22 — 21 — 20 — 19)(12-398603
1! р(ям ст изобретения
Составитель Г. Субботнна
Техред Е. Борисова
Редактор Л. Струве
Еоррегктор О. Тюрина
За!кав 3670 Изд. «¹" 1520 Тираж 456 Подписное
ПН1!!!П!! Государстве!иного комитета Совета Министров СССР ио делам изобретений и от:;рь!ти!«!
Москва, jK-35, Раугиская наб., д. 4/5
Обл. тии. Кос!ромского уиравлеиив издательств, rû,!a-.рафаи и книжной торгоис!а — 11 — 10 — 9 — 8 !!, длина,нооика колеблется от
3,1 до 7,6 р.
Физиолого-биохимичео!сие !п!ризна!к!и. Культура Alternaria tenuis растет при 20 — 35 С, оптимальная температура 27 — 30 С, растет при рН 2,6 — 8,0, оптимальный рН для роста .составляет 3,0 — 5,0. Гидрголи!зует лактозу и другие гала!ктоз и!дазы. Использует в качестве единственных источников углерода: ла ктозу, галактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу, арабинозу, трегалозу, целлобиозу, фруктозу, маннозу. Лзот тгспользуеп!ся в разных фор!мах: агммонийный, !нитратный. Более н!нтенсивный рост культуры наблюдается на азотно-гси!слов! ах!монн!и, на двухзамещенном фосфорно-кислом аммонии. Наиболее интен!сивный !рост наблюдается на сусло-агаре, среде Чапека и на дру.! пх средах, описанных выше.
1. Способ полу,ения ферментного препарата р-галактозидазы путем выращивания на пита5 тельной среде продуцирующих ее плесневых грибов в глубинных условиях, or,гичающийся тем, что, с целью повышения акпи!вности Р-галактозидазы, в качестве продуцируюгцих микроорганизмов используют:род Alternaria. !
О 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что пз рода используют вид tenuis.
3. Слособ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что из вида tenuis иопользуют штамм 123.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что !
5 данные мик роорганизсмы выращивают на питательной среде в при!сутствии соевой муки, л;!моHной кислоты и необходимы хгинеральных солей п рп р Н ее равном 2,0 — 6,0.
