Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10



Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной  -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10
Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной  -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10
Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной  -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10
Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной  -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10
Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной  -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10
Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной  -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10
Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной  -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10
Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной  -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10
Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной  -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10
Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной  -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10
Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной  -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10
Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной  -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10
Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной  -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10
Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной  -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10
Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной  -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10
Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной  -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10
Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной  -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10
Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной  -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10
Рекомбинантная белковая конструкция дсд-сп- -гал, обладающая активностью фермента термостабильной  -галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, плазмидная днк pgd-10, определяющая биосинтез дсд-сп- -гал, и штамм-продуцент escherichia coli dh5 /pgd-10

 


Владельцы патента RU 2428477:

Гришин Дмитрий Викторович (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения белка ДСД-сп-β-ГАЛ в клетках Е.соli. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pGD-10, кодирующую химерную белковую конструкцию ДСД-сп-β-ГАЛ, содержащую декстрансвязывающий домен ДСД из микроорганизма Leuconostoc mesenteroides, который генно-инженерным путем объединен через глицин-сериновый спейсер с термостабильной бета-галактозидазой из термофильного микроорганизма Thermoanaerobacter ethanolicus. Для получения штамма Escherichia coli DH5α/pGD-10 - продуцента рекомбинантной белковой конструкции ДСД-сп-β-ГАЛ, клетки родительского штамма Escherichia coli DH5α трансформируют рекомбинантной плазмидной ДНК pGD-10. Изобретение позволяет получить белок ДСД-сп-β-ГАЛ, обладающий активностью фермента термостабильной бета-галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном. 3 н.п. ф-лы, 4 ил.

 

ВВЕДЕНИЕ

Наиболее перспективными методами рециклизации бета-галактазидов на предприятиях, а также освобождения молочных продуктов от лактозы, которая может быть аллергенной для человеческого организма, является ферментативный способ гидролиза этих соединений как растворимыми формами соответствующих ферментов, так и иммобилизованными.

Они позволяют перерабатывать сырье без образования загрязняющих аддуктов, которые требуют сложных систем очистки продукта.

Иммобилизация бета-галактозидаз на доступных сорбентах (например, на декстранах) позволяет понизить производственные затраты, в частности затраты вследствие постоянного уноса фермента из жидкой фазы и потери его активности при повышении температуры, а также позволяет повысить срок службы фермента и производительность процесса.

Для иммобилизации бета-галактозидаз как в промышленности, так и в медицине до настоящего времени используют химические способы, при этом возрастает срок службы фермента, что незначительно снижает себестоимость процесса гидролиза бета-галактозидов, по сравнению с использованием растворимых форм фермента, однако при химической иммобилизации происходит значительная инактивация фермента, при этом использующиеся химические реагенты, обладая токсичностью, загрязняют продукт и ограничивают его использование в пищевой промышленности.

Для использования в пищевой промышленности большое будущее имеют бета-галактозидазы, обладающие повышенной термостабильностью, способностью аффинно связываться с соответствующим субстратом при широком диапазоне рН. Произвести подобный ферментный препарат возможно при использовании штаммов бактерий, трансформированных плазмидной ДНК, несущей ген бета-галактозидазы с улучшенными свойствами.

Науке известен рекомбинантный белок, обладающий активностью бета-галактозидазы (UniProt № Y 08557, SEQ ID NO: 3 приложения). Известна рекомбинантная плазмида, содержащая ген соответствующей бета-галактозидазы. Получен штамм E.coli DH5α, экспрессирующий данный белок, однако в таком виде этот фермент может быть иммобиллизован только химическими методами, которые, как известно, удорожают процесс. Известен способ иммобилизации бета-галактозидазы на пористом кремнеземе (авторское свидетельство СССР 1317024 А1, класс С12 от 15.04.87 г.); способ химической иммобилизации на активированной диметилацетамидом целлюлозе (авторское свидетельство СССР 1567625 А1, класс С 11/04, 11/12 от 30.05.90 г.). Данные методы требуют высокоочищенного фермента, который можно получить лишь в результате длительной многостадийной его очистки.

Но известен способ получения слитных белков с целлюлозосвязывающими доменами для иммобилизации и очистки белков на грануллированной целлюлозе (Patent US 5137819, Kilborn, et. al., 11.08.92).

Однако производство гранулированной целлюлозы как носителя не имеет широкого распространения и сопряжено с рядом сложностей, удорожающих процесс и конечный продукт, к тому же константа диссоциации (Кд) при связывании целлюлозосвязывающего домена и гранул целлюлозы составляет 10-6-10-7.

В генбанке же аннотирована последовательность декстрансвязывающего домена (ДСД) [1, 2], который в виде автономного белка способен показывать на порядок большую прочность связывания с декстрановыми сорбентами (Кд=10-9), промышленное производство которых более широко представлено, в отличие от производства грануллированной целлюлозы.

Технический результат данного изобретения заключается в создании экспрессионной плазмиды pGD-10 с геном белка ДСД-сп-β-ГАЛ (SEQ ID NO: 1 приложения), создании самого слитного белка ДСД-сп-β-ГАЛ, обладающего, с одной стороны, бета-галактозидазной активностью, а с другой - способностью связываться с декстранами при повышенной температуре (65-75°С).

Данный технический результат достигается созданием химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ, содержащего декстрансвязывающий домен ДСД из - Leuconosfcoc mesenteroides, соединенный через глицин-сериновый спейсер (GSGSGSGSGSGA) с термостабильной бета-галактозидазой из термофильного микроорганизма Thermoanaerobacter Ethanolicus.

Также данный технический результат достигается созданием рекомбинантной плазмидной ДНК pGD-10 5111 п.н. (SEQ ID NO: 1 приложения), содержащей синтетический оперон с геном слитного белка ДСД-сп-β-ГАЛ, включающий ранний промотор бактериофага Т5, нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ДСД-сп-β-ГАЛ (115-2802 п.н.) и терминатор транскрипции; ген бета-лактамазы, детерминирующий устойчивость к антибиотику ампициллину, и сайт инициации репликации типа ColE1. Таким образом, рекомбинантная плазмидная ДНК pGD-10 обеспечивает экспрессию белка ДСД-сп-β-ГАЛ в клетках E.coli.

Указанный технический результат достигается также тем, что штамм E.coli DH5a, трансформированный экспрессионным плазмидлным вектором pGD-10, является продуцентом целевого химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ.

На фиг.1 представлена экспрессионная плазмида pGD-10 с геном белка ДСД-сп-β-ГАЛ.

Описание процесса достижения технического результата

§1. Создание плазмидного экспрессионного вектора pGD-10

§1.1. Химический синтез олигонуклеотидов

Олигонуклеотиды были синтезированы твердофазным амидофосфитным методом с помощью синтезатора АСМ-100-2 (Новосибирск) и очищены методом электрофореза в 12% ПААГ (ЗАО «СИНТОЛ», ЗАО «Евроген»).

§1.2. Получение и клонирование гена ДСД из Leuconostoc mesenteroides

Ген декстрансвязывающего домена (ДСД) был получен благодаря ПЦР с помощью прямого и обратного праймеров (сайты рестриктаз подчеркнуты), фланкирующих генную последовательность ДСД, при этом в качестве ДНК-матрицы использовалась хромосомная ДНК Leuconostoc mesenteroides.

Праймеры:

ПЦР проводили на приборе Терцик (ДНК-технология, Россия). 25 мкл реакционной смеси содержали: 2,5 мкл Taq pol PCR buffer 10× (СибЭнзим), дНТФ в конечной концентрации 400 мкМ, 4×10-7 М каждого праймера, 1 мкл Taq pol (СибЭнзим) 5 ед. активности на реакционный объем, в качестве ДНК-матрицы использовалась хромосомная ДНК Leuconostoc mesenteroides. На реакционную смесь наслаивали 40 мкл вазелинового масла.

Параметры амплификации:

95°С - 5 мин; (94°С - 5 с, 60°С - 30 с, 72°С - 40 с)×30; 72°С - 5 мин; 10°С - хранение. Режим амплификации - точный.

Продукт амплификации размером 416 п.н. обрабатывали хлороформом, переосаждали этанолом и ресуспендировали в буфере TrisHCl 0,05 mM, рН 7,5. Для клонирования ПЦР-продукта он встраивался в коммерческий вектор pQE6 (Quageen, USA) методом лигирования полученных рестрикционных фрагментов по сайтам рестрикции Ncol, BglII/BamHI (при лигировании по одинаковым липким концам сайты BglII и BamHI исчезают). Лигирование проводилось посредством ДНК-лигазы фага Т4 при 4°С в соответствующем буфере в течение 24 часов.

Лигазной смесью трансформировали клетки Е.coli M15, которые затем отбирали на агаризованной среде LB с антибиотиками (ампициллин, канамицин). Затем плазмидная ДНК (pQEDBD) выделялась методом SDS щелочного лизиса, проверялась методом рестрикционного анализа и секвенирования на автоматическом секвенаторе.

§1.3. Получение экспрессионной плазмиды pQEDBDsp с геном ДСД из Leuconostoc mesenteroides со спейсером на С-конце.

Создание гена ДСД-(Gly-Ser)5, кодирующего белок ДСД и глицин-сериновый спейсер, необходимый для пространственного разделения различных функциональных доменов, осуществлялось в два этапа методом «праймеропосредованной прогулки», при этом происходило постепенное наращивание С-концевой спейсерной последовательности, для чего были спланированы следующие праймеры:

На первом этапе «праймеропосредованной прогулки» использовались праймеры GBD11F и RevDBD-1, на втором - GBD11F и RevDBD-2, последний спланирован внахлест с RevDBD-1. Как видно, для дальнейшего клонирования ПЦР фрагмента ДСД-(Gly-Ser)5 в бактериальный вектор pQE6 (Quageen, USA) в праймерах были спланированы сайты эндонуклеаз рестрикции NcoI и HindIII (отмечены на праймерах подчеркиванием). В качестве матрицы для проведения ПЦР использовали плазмидную ДНК pQEDBD. Реакция проводилась в автоматическом режиме на приборе Терцик (Россия) при следующих условиях:

95°С - 5 мин; (94°С - 5 с, 60°С - 30 с, 72°С - 40 с)×30; 72°С - 5 мин; 10°С - хранение. Режим амплификации - точный.

Далее по сайтам рестрикции NcoI и HindIII скорректированный ген ДСД, обладающий С-концевым спейсером, был интегрирован в бактериальный вектор pQE6 (Quageen, USA), при этом была получена экспрессионная плазмида pQEDBDsp с геном ДСД со спейсером на С-конце (SEQ ID NO: 2 приложения).

§1.4. Получение экспрессионной плазмиды pGD-10 с геном химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ

Плазмидная конструкция pGD-10 (Схема 0001) с геном химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ (SEQ ID NO: 1 приложения) была собрана посредством лигирования ранее полученных экспрессионных плазмид pQEDBDsp (с геном ДСД из Lenconostoc mesenteroides со спейсером на С-конце) и pQELacZTm (pR624) (с геном термостабильной бета-галактозидазы из термофильного микроорганизма Thermoanaerobacter Ethanolicus, любезно предоставлена Сергиенко О.В. ВНИИСБРАСХН) по рестрикционным сайтам BglII/BglI и BamHI/BglI соответственно.

Трансформацию и молекулярное субклонирование в E.coli DH5a проводили по стандартным методикам [3]. Выделение плазмидной ДНК осуществляли посредством метода SDS щелочного лизиса. Доказательство введения рекомбинантных ДНК в бактерии осуществлялось косвенным путем, на основе анализа выделенных плазмид с помощью рестрикционного скрининга. Идентичность клонированного в составе вектора pGD-10 гена ДСД-сп-β-ГАЛ была подтверждена секвенированием на автоматическом секвенаторе. В итоге была проклонирована и просеквенирована последовательность гена белка ДСД-сп-β-ГАЛ (фиг.2).

§2. Создание бактериального штамма - продуцента, обеспечивающего экспрессию белка ДСД-сп-β-ГАЛ в цитоплазме клеток Е.coli

Плазмидной ДНК pGD-10 с геном (ДСД-сп-β-ГАЛ) трансформировали клетки E.coli DH5a. Выбранный по результатам секвенирования продуцент E.coli DH5a выращивали на агаризованной среде LB, содержащей антибиотики ампициллин и налидиксовую кислоту для селекции, синтез белка индуцировали добавлением изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) в конечной концентрации 0,3 мМ, при достижении оптической плотности OD=0,9. Время индукции составляло 4,0 часа. Клеточные осадки подвергали ультразвуковой дезинтеграции, термолизу, после чего дебрис осаждали центрифугированием и собирали супернатант (растворимая фракция белка).

Уровень экспрессии целевого белка (102,3 кДа) составлял от 20 до 30% от общего клеточного белка, что показал электрофорез в 10% полиакриламидном геле относительно соответствующих контролей, в присутствии додецилсульфата натрия, также на базе термолизиса при 75°С была доказана термостабильность полученного белка.

В итоге был получен штамм, продуцирующий химерный рекомбинантный белок ДСД-сп-β-ГАЛ, растворимость которого составила порядка 80%.

§3. Изучение базовых свойств белка ДСД-сп-β-ГАЛ в лизатах клеток Е.coli

§3.1. Изучение декстрансвязывающих и ферментативных свойств белка ДСД-сп-β-ГАЛ в лизатах клеток Е.coli

Для этих целей 3 мл культуры DH5a [pGD-10] (бета-галактозидаза с ДСД) и DH5a [pQELacZTm] (термостабильная бета-галактозидаза без ДСД (LacZTm), в качестве положительного контроля) с соответствующими контролями до индукции обрабатывались по той же методике, что и в §2. Были отобраны растворимые фракции (супернатант), которые делились на две пробирки по 1,0 мл (dex(+) - с декстраном и dex(-) - без декстрана). К растворам dex(+) добавляли по 40 мг декстрана Sephadex G50, затем растворы инкубировались в течение 20 мин при 37°С, при постоянном помешивании, что необходимо было для связывания химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ с декстраном. Инкубированные пробы центрифугировались 5 мин при 4000 об/мин, после этого супернатанты (над декстраном) переносились в чистые пробирки (супернатант dex(+)).

Осадки же dex(+) ресуспендировались в 1 мл рабочего буфера (рН 7,4). После этого ко всем пробам добавлялся хромогенный субстрат, имеющий бета-галактозидазную связь (Xgal), в конечной концентрации 0,05 мг/мл. Реакционные смеси инкубировались 10 мин при оптимальной для термостабильной бета-галактозидазы температуре 65°С, после чего производился учет результатов. При этом в отрицательных контролях (буфер с декстраном без лизата с белком) и в супернатанте пробы ДСД-сп-β-ГАЛ dex(+) растворы остались не окрашенными, в то время как растворы в положительных контролях (супернатант пробы pQELacZTm dex(+)) и в осадках опытной пробы dex(+) изменили свой цвет со светло-желтого до сине-зеленого, что говорило о расщеплении субстрата Xgal, т.е. о наличии бета-галактозидазной ферментативной активности, а соответственно, и наличии декстрансвязывающих свойств нашего белка (см. фиг.3; фиг.4).

Таким образом, факт того, что окрашивание развивается преимущественно в осадочных опытных пробах dex(+), свидетельствует о декстрансвязывающих свойствах химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ. Данные свойства оценивались также и по характеру окрашивания осадков декстрана в образце dex(+) (осадок) и в положительном контроле dex(+) (осадок). Сине-зеленое окрашивание в образце белка ДСД-сп-β-ГАЛ локализуется преимущественно в области осадка декстрана, в то время как в положительном контроле, наоборот, осадок не прокрашен, а надосадочная жидкость приобрела сине-зеленый цвет. Это и отсутствие белка нужного мол. веса на 10% ПААГ в супернатанте dex(+), слитом после обработки лизата клеток с конструкцией pGD-10, декстраном, доказывает, что созданная рекомбинантная конструкция обладает декстрансвязывающими свойствами.

§3.2. Изучение бета-галактозидазной активности химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ в лизатах клеток DH5a [pGD-10]

Клетки с экспрессионной плазмидой pGD-10 выращивали в 4 мл среды LB до достижения оптической плотности 0,9 при λ=550, затем пробу индуцировали добавлением 4 мкл 0,3М ИПТГ, при этом время индукции составило 4 часа. Затем отбирали 500 мкл индуцированной культуры, осаждали 10 мин при 6000 об/мин и ресуспендировали в 500 мкл рабочего буфера, содержащего 50 мМ Tris-HCl; 10 мМ CaCl2, 10 мM MnCl2; 0,1 мМ β-Mercaptoethanol; pH 7,4. После этого пробу лизировали ультразвуком и избавлялись от клеточного дебриса центрифугированием в течение 10 мин при 13000 об/мин.

Далее в лизатах клеток определялась собственно бета-галактозидазная активность белка ДСД-сп-β-ГАЛ по способности гидролизовать ОНФГ (орто-нитро-фенил-β-D-галактопиранозид) с образованием галактозы и окрашенного в желтый цвет соединения 2-нитрофенола.

Для этих целей к 0,1 мл лизата добавляли 0,7 мл рабочего буфера и 0,2 мл ОНФГ (4 мг/мл), после чего реакционную смесь инкубировали 15 мин при температуре 65°С. Останавливалась реакция добавлением раствора 1М карбоната натрия.

За единицу активности принимали количество 2-нитрофенола, образующегося за 1 мин. Концентрацию 2-нитрофенола рассчитывали спектрофотометрически при λ=420 нм. Таким образом, было рассчитано, что ферментативная активность нашего белка составила 5 ед/мкл белка при 65°С и рН 7,4.

Далее, в приложении, приведен перечень биоинформационных последовательностей.

Приложение

SEQ ID NO: 1 Нуклеотидная последовательность рекомбинантной плазмиды pGD-10 размером 5111 п.н. и аминокислотная последовательность целевого белка ДСД-сп-β-ГАЛ.

Список литературы

1. Suwannarangseea S., Moulisb С., Potocki-Veroneseb G., Monsanb P. / Surisa Search for a dextransucrase minimal motif involved in dextran binding, FEBS Letters, 4675-4680, - Tailand 2007.

2. Olvera С., Fernandez-Vazquez J., Ledezma-Candanoza L. / Role of the C-terminal region of dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides IBT-PQ in cell anchoring, Microbiology, 3994-4002, - 2007.

3. Маниатис Т. Молекулярное клонирование: учебник / Т.Маниатис и др. - M.: Мир, 1984. - С.450.

1. Рекомбинантная белковая конструкция ДСД-сп-β-ГАЛ, обладающая активностью фермента термостабильной бета-галактозидазы (лактазы) и способностью аффинно связываться с декстраном, представляющая собой декстрансвязывающий домен ДСД из микроорганизма Leuconostoc mesenteroides с аминокислотной последовательностью, приведенной в виде SEQ ID NO: 2, который генно-инженерным путем объединен через глицин-сериновый спейсер (GSGSGSGSGSGA) с термостабильной бета-галактозидазой из термофильного микроорганизма Thermoanaerobacter ethanolicus с аминокислотной последовательностью, приведенной в виде SEQ ID NO: 3.

2. Плазмидная ДНК pGD-10, определяющая биосинтез белка ДСД-сп-β-ГАЛ и характеризующаяся последовательностью нуклеотидов, приведенной в виде SEQ ID NO: 1.

3. Штамм Escherichia coli DH5α/pGD-10 - продуцент рекомбинантной белковой конструкции ДСД-сп-β-ГАЛ, полученный путем трансформации клеток материнского штамма E.coli DH5α плазмидной ДНК pGD-10 по п.2.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и касается варианта ДНК, связанного с гиполактазией взрослого типа. .
Изобретение относится к микробиологической промышленности и предназначено для получения эндо-(1-4-)-бета-ксиланазы и бета-галактозидазы. .
Изобретение относится к микробиологической промышленности и, в частности, генетической инженерии и представляет собой фрагмент ДНК мицелиального гриба Penicillium canescens, кодирующий синтез секретируемой -галактозидазы, и штамм Penicillium canescens продуцент b-галактозидазы, сконструированный методами генетической инженерии на основе этого фрагмента.

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологическому получению ферментных препаратов и может найти применение в производстве ферментов, используемых в пищевой промышленности, преимущественно при производстве молочных продуктов.

Изобретение относится к биотехнологии, частности к получению нового продуцента фермента β - галактозидазы. .

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантного интерлейкина-11 (рИЛ-11) человека. .

Изобретение относится к рекомбинантному химерному белку фактора ингибирования нейтрофилов и гиругена (TNHH), кодирующей его полинуклеотидной последовательности, рекомбинантному вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, микроорганизму, трансформированному указанным вектором, и фармацевтической композиции, содержащей указанный рекомбинантный химерный белок фактора ингибирования нейтрофилов и гиругена.

Изобретение относится к способу выделения рекомбинантных белков из трансформированных хозяев. .

Изобретение относится к области медицины и касается способов лечения заболеваний антагонистами VEGF. .

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к носителям для доставки лекарственного средства, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к области модификации гликозилирования белков. .

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению генно-инженерных вакцин, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой PS4-вариантный полипептид, получаемый из исходного полипептида, имеющий немальтогенную экзоамилазную активность, который по меньшей мере на 60% идентичен любой из SEQ ID NO:1-14, причем PS4-вариантный полипептид содержит аминокислотную мутацию в одном или нескольких положениях, выбранных из группы, состоящей из 146, 229, 303, 306, 309, 316, 353, 26, 145, 339, относительно нумерации положений последовательности экзоамилазы Pseudomonas saccharophilia, представленной как SEQ ID NO:1.
Наверх