Способ получения сложных эфиров нуклеозиддифосфата

 

Союз СОм таких

Республик

К ПАТЕНТУ

Зависимый от патента №

М. Кл. С 07d 51/50

Заявлено 02.Xll.1971 (№ 1721408/23-4) Приоритет 02.XII.1970, № P 2059429.0, ФРГ

Гооудврствеииый комитет

Совета и1иииотров СССР

„ „ „„щ В твии„-, Опубликовано 21,Х1.1973, Бюллетень № 46

УДК 547.857.7.07(088.8) и отвро1тий

Дага опуоликовани"", описания 11Л I.1974

Авторы изобретения

Иностранцы

Ханс Ульрих Бергмейер (Федеративная Республика Германии), Михаель Нельбек-Хохштеттер (Австрия) Гюнтер Вейманн и Эрих Хайд (Федеративная Республика Германии) Иностранная фирма

«Берингер Маннхайм ГмбХ» (Федеративная Республика Германии) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЛОЖНЫХ ЭФИРОВ

НУКЛ ЕОЗИДДИФОСФАТА

Изобретение относится к способу получения соединений, которые могут найти применение в фармацевтической промышленности.

Известен способ получения сложных эфиров нуклеозиддифосфата путем взаимодействия нуклеозидфосфата с эфиром фосфорной кислоты в присутствии дициклогексилкарбодиимида в пиридине или формамиде как растворителе.

Однако этот способ характеризуется большой продолжительностью реакции (7 дней), многочисленными побочными продуктами и неудовлетворительным выходом (менее 45%).

Предлагаемый способ заключается в том, чго метапольный 1)аст110р пуклсозидмонофосфорной кислоты и дициклогсксилкарбодиимида, содержащий агент растворения, подверга1от взаимодействи1О путем медле1п1ого добавления, например по каплям, кислого метанольного раствора эфира фосфорной кислоты с последующим выделением целевого продукта извсстпыAI спосооом. Реакцшо обычно проводят при тсмпературс ОГ 0 до 80"С, преимущественно при комнатной тсмпературс. в течение нескольких часов с выходом до 90% и гыше.

В качестве нуклеозидмонофосфорной кислоты используют, как природные, так и синтетические нуклеозиды. В качестве второй компо5 ненты применяется эфир фосфорной кислоты.

При этом фосфорная кислота может быть этерифицирована при помощи какого-нибудь соответствующего, содержащего гидроксильные группы органического соединения; пред10 полагается, что этот эфир фосфорной кислоты достаточно растворим в примененном согласно изобретению растворителе. Примерами органических соединений, которые могут применяться в форме их эфиров фосфорной кислоты, 15 являются одно- и многоатомные спирты н аминоспирты, например, этаноламин, колин, сахар, например глюкоза, манноза, галактоза, рибоза, глицериновый альдегпд, а также соответствующие кетозы и аминосахар, Предпоч20 тительными эфирами фосфорной кислоты являются холинфосфат, этанолампнфосфорная кислота, глюкоза 1-фосфат, глюкоза-б-фосфат, галактоза-1-фосфат и манноза-1-фосфат, глюкозамии-1-фосфат, галактозамин-1-фосфат и

407449 другие, маннозамин-1-фосфат и соответствующие N-ацетилсоединения.

В качестве растворителя применяется метанол. Метанол может частично заменяться алканоламп с четырьмя атомами углерода или низшими диалкилкетонами с тремя углеродными атомами на одну алкильную цепь или диметилформамидом. Однако выход в результате этого ухудшается. Особенно хорошие результаты получают в присутствии растворителя. Соответствующими растворителями являются, например, пиперидин, циклогексиламин и анилин, а также преимущественно морфолин. Метанольный раствор эфира фосфорной кислоты обычно должен иметь рН от 1,0 до 6,5, предпочтительно от 4,0 до 5,0. В качестве кислоты для регулирования величины рН в требуемой области могут использоваться как неорганические, так и органические кислоты, которые растворимы в примененном растворителе. Предпочитают галогеноводородные кислоты, особенно хлористоводородную кислоту.

Вследствие того, что при способе изобретения допустимо применение воды, могут применяться кислоты в виде водного раствора, например концентрированная соляная кислота.

Подходящими кислотами являются такие, которые не ведут к осаждению компоненты реакции или дают с последней необратимую реакцию (например, серная кислота, азотная кислота). Эфиры фосфорной кислоты могут применяться в форме их солей, например, щелочных и щелочно-земельных металлов, предпочтительно солей кальция. Предполагается, что ионы кальция при этом способствуют растворению. Однако оказались пригодными также соли натрия, калия, лития, стронция, магния и бария и соли органических аминов. Могут применяться также смешанные соли кальция, например смешанные соли с галогеноводородными кислотами, как, например, хлористый холинфосфаткальций, Пример 1. 10 г уридин-5 -монофосфата (У-5 -МФ) в виде свободной кислоты (около

30 ммоль) растворяют в 500 мл чистого метанола, добавляют 7,5 мл морфолина и нагревают, после добавления 10 г дициклогексилкарбодиимида до 50 С. К этому раствору медленно добавляют по каплям 90 ммоль глюкоза-1-фосфата в виде соли морфолина, растворенной в 500 мл метанола с рН 4,0, Через 12—

15 час. реакции при 50 "С добавляют при хорошем перемешивании 500 мл изопропанола, осажденный осадок отделяют центрифугпрованием, растворяют в 250 мл воды, нейтрализуют, подают на колонну 1МАС-А-17 (объемом 500 мл, в форме формиата) и вымывают с линейным градиентом 0 — 0,5 и. формиата аммония с рН 4. Фракции с УДФ-глюкозой, которые поступают с колонны при содержании

0,4 н, формиата аммония, сразу обессоливают на колонне с углем объемом 2 л. Вымывание угля производят смесью изопропанола: Н О:

: едкого натра = 50: 50: 0,5. Элюаты доводят при помощи натриевой щелочи до величины

65 рН 7,2, раствор концентрируют в вакууме и натриевую соль УДФ-глюкозы осаждаю г

10-кратным объемом метанола.

Выход: 8,5 — 9 г (около 50 Д теории, в пересчете на исходный У = 5 = МФ).

Аналогично получают соответствующую

УДФ-галактозу при помощи галактозы-1-фосфата, соли морфолина.

Пример 2. 15 г галактозы-!-фосфата, соли морфолина, растворяют в 500 мл метанола, и добавлением концентрированной соляной кислоты величину рН раствора доводят до 4. Этот раствор медленно добавляют по каплям к 200 мл метанольного раствора с температурой 50 С, который содержит 5 r аденозин-5 монофосфата (А-5 -МФ) в виде свободной кислоты, 3,5 мл морфолина и 5 г дпциклогексилкарбодиимида. После 15 час, реакции при

50 С, при величине рН 4 — 4,5 добавляют при хорошем перемешнванпи 250 мл изопропанола.

Осажденный осадок отделяют центрифугпрованием, растворяют в 200 мл дистиллированной воды, устанавливают величину рН и, наконец, поглощают на колонне с анионообменной смолой (объем 500 мл, тип Дауэкс 1 Х 2, в форме формиата). Продукт элюируют 0,7 н. раствором формиата натрия и обрабатывают дальше углем, как в примере 1.

Выход АДФ-галактозы, соли натрия, составляет 4,5 r (около 50, теории в пересчете на введенный А-5 -МФ) .

Пример 3. 14,5 r. этаноламинофосфорной кислоты (около 100 ммоль) и 15 г хлористого кальция (СаС1 .2НО) растворяют в 55 мл дистиллированной воды, подкисляют приблизительно 5 мл концентрированной соляной кислоты и объем доводят метанолом до 500 мл.

Полученный раствор медленно добавляют по каплям к горячему раствору метанола (250 мл) с температурой 50 С, который содержит 11 г цитидин-5 -монофосфата (Ц-5 -МФ) в виде свободной кислоты, 8 мл морфолина и

11 г дициклогексилкарбодиимида, Приблизительно через 15 час. реакции при 50 С добавляют 300 мл изопропанола, осадок отфильтровывают, растворяют в воде, нейтрализуют и хроматографируют на колонне с анионообменной смолой (типа Дауэкс 1 Х 2, в форме формиата, 50 — 100 меш, объем 1000 мл). После предварительной промывки при помощи 0,02 н, муравьиной кислоты, элюируют ЦДФ-этаноламин. Полученную фракцию концентрируют, нейтрализуют едким натром и, наконец, кристаллизуют добавлением этанола, Кристаллы промывают этанолом и сушат.

Выход: около 12 г (70О теории в пересчете

»а введенный Ц-5 -МФ).

Пример 4, 2 г цитидинфосфорной кислоты растворяют в 100 мл чистого метанола, добавив 1,5 мл морфолина, и, после добавления 2 r дициклогексилкарбодиимида, нагревают приблизительно до 50 С. К полученному раствору медленно добавляют по каплям раствор из 5 г холинфосфата — хлористого кальция в 175 мл метанола, который содер407449

Составитель В. Жестксв

Текред Е, Борисова

Корректор Е. Сапунова

Редактор Л, Струве

Заказ 712/!О Изд. № 1027 Тираж 511 Подписное

ЦИИИПИ Государственного комитета Совста,11ииистрс в СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Ж-35, Раушская иаб., д. 4, 5

Типография, пр. Сапунова, 2

Б жит 2,0 мл 36 4-ной соляной кислоты. В1ерез

12 — 15 час. реакции при 50 С добавля1от при хорошем перемешивании 250 мл изопропанола. Осажденный осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 200 мл дистиллированной воды и в виде формиата подают на хроматографическую колонну с 250 мл анионообменной смолы Дауэкс 1 Х 2. Колонну промывают 500 мл дистиллированной воды и элюируют посредством 0,05 н. муравьиной кислоты. Содержащие цитидпндифосфатхолин фракции концентрируют досуха, растворяют

В небольшом количестве воды, нейтрализуют натриевой щелочью и кристаллизуют добавкой этанола.

HhIxoJ .3,2 г цитидипдифосфатхолина — N3 411„0 (90% теории).

Пример 5. 5 г гуанидин-5 -,!онофосфата в виде свободной кислоты, растворяют в

100 мл дистиллированной НаО и 5 мл морфолина и концентрируют приблизительно до

15 мл. К маслянистому концентрату добавляют 100 мл метанола, 2 мл морфолина н 8 г дициклогексилкарбодиимнда, При слабом перемешпвании в реакционпуlî смесь медленно добавляют по каплям при 50 — 55 С раствор из 15 r глюкозы-1-фосфата, соли морфолина, в 500 мл метанола при рН 4,0. По окончании добавления раствора величину рН устанавливают при помощи концентрированной НС1 до

4 5. Через 10 — 15 час. при рН 4 5 реакция заканчивается. Реакционный раствор концентрируют в вакууме приблизительно до 200 мл, и полученную гуанозиндифосфат-глюкозу осаждают добавлением 400 мл изопропанола.

Осадок растворяют в НаО, нейтрализуют и очищают, как описано в примере 1, на колонне

1МЛС-Л-17, угольную кислоту обессолпвают и

5 осаждают метанолом.

Выход: 3,5 г (40% теории) ГДФ-глюкозы Na2, Пред ает изобретения

1. Способ получения сложных эфироь нуклеозиддифосфата реакцией нуклеозндфосфата с эфиром фосфорной кислоты в присутствии днпиклогекснл кар боднимида с после15 дующим выделением целевого продукта известным способом, о т.l н ч а ю ш, и I! с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения процесса, метанольный раствор нуклеозпдмонофосфорной кислоты и

20 дин пк 70I Li

25 2. Способ по II. 1, отличающийся тем, что реакцию проводят прп температуре от 0 до 80 С.

3. Cilocclo IIo 17. 1, 0 T al II l а Io I17, н Й c H что В качестве агента растворения нсполь30 зуют морфолин.

4, Способ по п. 1, отл пч а ю щи йся тем, lTo эфир фосфорной кислоты ВВОдят В рсакциlo в виде соли щелочного нли щелочноземельного металла, например соли кальция.