Фосфолипидные производные нуклеозидов и фармацевтическая композиция

 

Использование: в качестве антивирусных препаратов. Сущность соединения формулы I где R₁-R₂ - линейная или разветвленная, С₈-С₁₅ - алкильная цепь, n= 0,1 или 2, а B представляет собой остаток нуклеотида, способ их получения, а также антивирусные лекарственные средства, содержащие эти соединения. 2 с. и 3 з.п.ф-лы, 9 табл.

Целью изобретения являются новые фосфолипидпроизводные нуклеозидов общей формулы 1, , где0 R₁ - неразветвленная или разветвленная, насыщенная или ненасыщенная алкильная цепь с 8-15 углеродными атомами, которая может быть однократно или многократно замещена фенильными группами, галогеном, C₁-C₆-алкокси-, C₁-C₆-алкилфенильными группами, галогеном, C₁-C₆-алкокси-, C₁-C₆-алкилмеркапто-, C₁-C₆-алкоксикарбонил-, C₁-C₆-алкилсульфинил- или C₁-C₆-алкилсульфонил-группами, R₂ - неразветвленная или разветвленная алкильная цепь с 8-15 углеродными атомами, которая может быть замещена при необходимости однократно или многократно фенильными группами, галогеном, C₁-C₆-алкокси-, C₁-C₆-алкилмеркапто-, C₁-C₆-алкоксикарбонил или C₁-C₆-алкилсульфонил-группами, R₃ - водород или гидрокси-группа, R₄, R₅ - соответственно водород или из остатков R₄ и R₅ галоген, гидрокси-, циано- или азидо-группа и кроме того, R₃ и R₄ могут представлять собой еще одну связь между C-2' и C-3', n - 1 или 2, а
B - одно из следующих соединений:
1. ,
причем R₆ может быть водород, алкильная цепь с 1-4 углеродными атомами или галоген,
2. ,
при этом R₇ - это может быть водород, алкильная цепь с 1 - 4 углеродными атомами или галоген,
3. ,
при этом R₈ может быть водород, алкильная цепь с 1 - 4 углеродными атомами, галоген, или гидрокси- или амино-группа,
4. ,
причем R₉ может быть водород или амино-группа, и
R₁₀ означает водород, галоген, C₁-C₆-алкокси, C₁-C₆-алкилмеркапто, или амино-группу, которая может быть моно- или ди- замещена посредством C₁-C₆-алкил, C₁-C₆-алкокси-, гидрокси-, C₂-C₆-алкил- и/или C₃-C₆-циклоалкил-, арил-, гетарил-, аралкил- или гетарилалкил-групп, которые при желании в арильном или в гетарильном остатке могут быть еще замещены одной или несколькими гидрокси-, метокси-, или алкильными группами, или галогеном, или аллилом, который при необходимости может быть замещен моно- или диалкил- или алкокси-группами,
их таутомеры и их физиологически совместимые соли неорганических и органических кислот или оснований, а также способ их получения и лекарственных средств, содержащих эти соединения.

Поскольку соединения общей формулы I содержат ассиметрические углеродные атомы, то и все оптически активные формы и рацемические смеси этих соединений также являются предметом изобретения.

В J. Biol. Chem. 265, 6112 /1990/ описан способ получения и применения липонуклеотидов в качестве антивирусных лекарственных средств. Исследованы и синтезированы были однако здесь только лишь связанные с известными нуклеозидами, как например AZT и ddC, димиристоилфосфатидил и дипальмитоилфосфатидил-остатки с их структурой сложных эфиров жирной кислоты.

В публикации J. Med. Chem. 33, 1380 /1990/ описаны нуклеозидконъюгаты липидов тиоэфира с цитидиндифосфатом, которые обладают противоопухолевым действием и которые могли бы найти применение в онкологии.

В "Chem. Pharm. Bull. " 36, 209 /1988/ описаны 5'-/3-SN-фосфатидил/нуклеозиды с антилейкемической активностью, а также их ферментативный синтез из соответствующих нуклеозидов и фосфохолинов в присутствии фосфолипазы D с активностью трансферазы.

Ферментативный синтез липонуклеотидов описан также в "Tetrahedron Lett". 28, 199 /1987/ и Chem. Pharm. Bull. 36, 5020 /1988/.

Соединения данного изобретения обладают также ценными фармакологическими свойствами. В частности они пригодны для терапии и профилактики инфекций, вызванных DNA-вирусами, как, например, Herpes - Simplex-вирус /простой лишай/, вирус цитомегалии, Папова-вирус, вирус опоясывающего лишая - ветряной оспы или вирус Эпштайн-Барр'а или RNA-вирусы, как Toga-вирусы или особенно ретро-вирусы, как онко-вирусы HTLV-I и II, а также лентивирусы Visna и человеческий вирус иммунной слабости HIV-1 и 2.

Особенно пригодными представляются соединения формулы I для лечения клинических проявлений ретровиральных HIV-нфекций у людей, как при длительной генерализированной лимфаденопатии /PJL/, прогрессирующей стадии родственного СПИД-комплекса /ARC/ и клинической картине СПИДа.

Неожиданным образом было теперь найдено, что соединения общей формулы I способствуют торможению размножения DNA- и/ или RNA-вирусов на стадии, специфичной для вируса DNA- или RNA-транскрипции. Эти вещества посредством ингибирования энзима Reverse Transkriptase могут оказывать влияние на размножение ретровирусов /см. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83, 1911, 1986 или Nature 325, 773 1987/. Особый терапевтический интерес представляет тормозящее влияние на HIV-вирус, виновника заболевания иммунной слабости - СПИДа. Для лечения СПИДа в настоящее время допускается у СПИД-пациентов только лишь 3'-ацидо-3' дезокситимидин /DE-A-3608606/. Однако токсические побочные действия 3'-ацидо-3'-дезокситимидина на костный мозг примерно у 50% пролеченных пациентов вызывают необходимость осуществления переливаний крови. Соединения общей формулы I не обладают этим недостатком. Они оказывают антивирусное действие, не проявляя себя цитотоксически в фармакологически в существенных дозах.

Соединения данного изобретения и их фармацевтические приготовления можно использовать также в сочетании с другими лекарственными средствами для лечения и профилактики названных инфекций. Примеры других лекарственных средств содержат средства, которые можно использовать для лечения и профилактики HIV-инфекций или заболеваний, сопутствующих этой болезни, как 3'-ацидо-3'-дезокситимидин, 2', 3'-дидезоксинуклеозиды, как например, 2', 3'-дидезоксицитидин, 2', 3'-дидезоксиаденозин и 2', 3'-дидезоксиинозин, ациклические нуклеозиды /например, ацикловир/, интерферон, как, например, A-интерферон, почечные ингибиторы выделения, как например, пробеницид, нуклеозид-транспорт-ингибиторы, как, например, дипиридамол, а также иммуномодуляторы, как, например, интерлейкин II или факторы стимуляции, как, например, фактор гранулоцит - Маркофаг - колонии. Соединения данного изобретения и другое лекарственное средство могут отпускаться соответственно по отдельности, одновременно в одном единственном приготовлении или в двух раздельных приготовлениях, или в различные периоды времени, так чтобы обеспечивалось достижение синергетического эффекта.

Как возможные соли соединений общей формулы I можно рассматривать прежде всего щелочные соли, щелочно-земельные и аммониевые соли фосфатной группы. Как щелочные соли предпочитают соли лития, натрия и калия. В качестве щелочно-земельных солей рассматриваются в частности соли магния и кальция. Под солями аммония согласно изобретению следует понимать соли, содержащие ион аммония, который может быть замещен до четырех раз на алкильные остатки с 1-4 углеродными атомами и/или аралкильные остатки, предпочтительно бензиловые остатки. Заместители могут быть при этом одинаковыми или различными.

Соединения общей формулы I могут содержать основные группы, в частности амино-группы, которые с помощью соответствующих кислот могут быть переведены в соли, образующиеся присоединением кислот. Как кислоты можно при этом рассматривать, например соляную, бромисто-водородную, серную, фосфорную, фумаровую, янтарную, винную, лимонную, молочную, малеиновую или метансульфокислоту.

В общей формуле I R₁ обозначает преимущественно неразветвленную C₁₀-C₁₄ алкильную группу, которая еще может быть замещена на C₁-C₆-алкокси или C₁-C₆-алкилмеркапто-группу. R₁ представляет, в частности, децил-, ундецил-, додецил-, тридецил-, или тетрадецил-группу. Как C₁-C₆-алкокси-заместитель R₁ рассматриваются преимущественно метокси-, этокси-, бутокси- и гексилокси-группы. Если R₁ замещено на C₁-C₆-алкилмеркапто-остаток, то под этим следует понимать, в частности, метилмеркапто-, этилмеркапто-, пропилмеркапто-, бутил-меркапто- и гексилмеркапто-остаток, а n - это одно из чисел 0, 1 или 2.

R₂ означает в основном неразветвленную C₁₀-C₁₄-алкильную группу, которая может быть еще замещена на C₁-C₆-алкокси-группу или на C₁-C₆-алкилмеркапто-группу. R₂ представляет собой, в частности, децил-, ундецил-, додецил-, тридецил-, или тетрадецил-группу. Как C₁-C₆-алкоксизаместители R₂ рассматриваются преимущественно метокси-, этокси-, пропокси-, бутокси- и гексилокси-группы.

Если R₂ замещено на C₁-C₆-алкилмеркапто-остаток, то под этим понимают в частности метилмеркапто-остаток, этилмеркапто-, бутилмеркапто- и гексилмеркапто-остаток.

R₄ и R₅ означают преимущественно соответственно водород или один из двух остатков, предпочтительно циано- или ацидо-группу, или атом галогена, как фтор, хлор, бром или йод.

Особенно предпочтительными являются соединения, в которых R₃ и R₄ представляют атом водорода, R₅ циано, ацидо или фтор; R₅ означает водород, а R₃/R₄ представляют собой еще одну связь между C-2' и C-3'.

В основаниях B общей формулы I остатки R₆ или R₇ означают предпочтительно атом водорода, метиловый, этиловый, пропиловый или бутиловый остаток, или атом галогена, как фтор, хлор, бром или йод. Особенно предпочтительным является для R₆ или R₇ атом водорода, метиловый или этиловый остаток и атом хлора или брома.

Остаток R₈ - преимущественно атом водорода, метиловый, этиловый, пропиловый или бутиловый остаток, амино-группа или атом галогена, как фтор, хлор, бром или йод, предпочтительно хлор или бром.

R₁₀ означает преимущественно атом водорода, фтора, хлора или атом брома, C₁-C₆-алкоксигруппу, в частности метокси-, этокси-, пропокси-, бутокси- или гексилокси-группу, C₁-C₆-алкилмеркапто-группу, в частности метилмеркапто-, этилмеркапто-, бутилмеркапто- или гексилмеркапто-группу, или аминогруппу, которая может быть одно- или двузамещенной на C₁-C₆-алкил-группу, как, например, метил-, этил-, бутил- или гексил-группу, на гидрокси-, C₂-C₆-алкил-группу, как, например, гидроксиэтил-, гидроксипропил-, гидроксибутил-, или гидроксигексил-группу, на C₃-C₆ у циклоалкильный остаток, как, например, циклопропиловый, циклопентиловый или циклогексиловый остаток, на арил, предпочтительно фенил, на аралкильный остаток, как в частности бензил, который в данном случае может быть замещен еще на одну или несколько гидрокси- или метокси-группы, на C₁-C₆-алкильные группы, как, например, метиловую, этиловую, пропиловую, бутиловую или гексиловую группу или на атомы галогена, как фтор, хлор или бром. Аминогруппа может быть замещена также на гетерарилалкильный или гетарильный остаток, как в частности, тиениловый, фуриловый или пиридиловый остаток. Под гетерарилалкильным остатком понимают предпочтительно тиенилметиловый остаток, фурилметиловый или пиридил-метиловый остаток.

Предпочтительно связанные нуклеозиды в заявленных липонуклеотидах общей формулы I следующие:
-2', 3'-дидезокси-3'-азидоуридин
-2', 3'-дидезоксиинозин
-2', 3'-дидезоксигуанозин
-2', 3'-дидезоксицитидин
-2' 3'-дидезоксиаденозин
-3'-дезокситимидин
-2', 3'-дидезокси-2', 3'-дидегидро-N⁶-/O-метилбензил/аденозин
-2', 3'-дидезокси-2', 3'-дидегидро-N⁶-/2-метилпропил/аденозин
-2', 3'-дидезокси-3'-ацидогуанозин-3'-дезокси-3'-ацидотимидин
-2', 2'-дидезокси-3'-фтор-5-хлоруридин
-3'-дезокси-3'-фтортимидин
-2', 3'-дидезокси-3'-фтораденозин-2', 3'-дидезокси-3'-фтор-2,6-диаминопуринрибозид
-2', 3 -дидезокси-2', 3'-дидегидроцитидин
-3'-дезокси-2', 3'-дидегидротимидин
-3'-дезокси-2', 3'-дидегидротимидин
-3'-дезокси-3'-ацидотимидин.

Соединения общей формулы I могут быть получены тем, что
1. Соединение общей формулы II,
,
где R₁, R₂ и n имеют указанные значения, подвергают взаимодействию с соединением общей формулы III,
,
где R₃ представляет собой водород или гидрокси-группу, защищенную посредством обычной для специалиста кислородной защитной группой,
- соответственно водород, галоген, ацидо-, циано-остаток, или один из остатков гидрокси-группы, защищенной посредством обычной для специалиста кислородной защитной группой, или
- еще одну связь, и
B имеет указанные значения,
в присутствии фосфорокситрихлорида и сложного эфира фосфорной кислоты и третичного азотного основания, например пиридина или триэтиламина, в инертном растворителе, как, например, толуол, и после осуществленного гидролиза согласно обычному в химии нуклеозида способу отщепляют кислородные защитные группы, или
соединение общей формулы IV:
,
в которой
R₁, R₂ и n имеют вышеназванные значения, подвергают взаимодействию с соединением общей формулы III, в которой и B имеют указанные значения, в присутствии фосфолипазы в инертном растворителе, как, например, хлороформ, в присутствии соответствующего буфера, и после завершения реакции при необходимости согласно обычному в химии нуклеозидов способу отщепляют кислородную защитную группу.

Получение соединений общей формулы II и IV описаны в Lipids 22, 947 /1987/ и в патенте DE-A-3039629.

Получение соединений формулы III описаны, например, в европейском патенте EP-A-0286028 и WO 90/08147.

Соединения, подобные общей формуле I, описаны в EP-A-0350287. Там однако описан лишь 1,2-сложный диэфир глицерина.

В патенте США N 4734232, кл. A 61 K 31/70, 1988, описаны фармацевтические композиции, обладающие ингибирующей активностью в отношении вирусной обратной транскриптазы, на основе фосфатов нуклеотидов и содержащие фармацевтически приемлемые носители.

Содержащие лекарственные средства соединения формулы I для лечения вирусных инфекций можно применять в жидком или в твердом виде энтерально или парентерально. При этом рассматриваются обычные формы применения, как, например, таблетки, капсулы, драже, сироп, растворы или суспензии. Как инъекционная среда используется преимущественно вода, содержащая обычные в инъекционных растворах добавки, как стабилизирующие средства, агенты растворения и буферы. Подобные добавки - это, например, тартрат- и цитрат-буфер, этанол, комплексообразователь, как этилендиаминтетрауксусная кислота и ее нетоксические соли, высокомолекулярные полимеры, как жидкий полиэтиленоксид для регулирования вязкости. Жидкие наполнители - это, например, крахмал, лактоза, маннит, метилцеллюлоза, тальк, высокодисперсные кремневые кислоты, высокомолекулярные жирные кислоты, как стеариновая кислота, желатин, агар-агар, фосфат кальция, стеарат магния, животные и растительные жиры, твердые высокомолекулярные полимеры, как полиэтиленгликоли и т.д. Препаративные формы, пригодные для орального применения, могут при желании иметь вкусовые или подслащивающие вещества.

Дозировка может зависеть от различных факторов, как способ применения, вид применения, возраст или индивидуальное состояние. Предложенные соединения применяют обычно в количествах 0,1-100 мг, преимущественно 0,2-80 мг в день и на кг веса тела. Предпочтительным является то, что суточную дозировку можно разделить на 2-5 применений, причем при любом применении отпускаются 1-2 таблетки с содержанием биологически активного вещества 0,5-500 мг. Эти таблетки могут иметь такое замедленное действие, в результате чего число применений в сутки сокращается до 1-3. Содержание биологически активного вещества таблеток с замедленным действием может доставлять 2-1000 мг. Биологически активное вещество может даваться также в результате продолжительных вливаний, при этом обычно достаточными являются количества 5-1000 мг в сутки.

В смысле предложенного изобретения помимо соединений, названных в примерах, и всех значений заместителей, названных в пунктах формулы, рассматриваются следующие соединения формулы I:
1. (3-додецилмеркапто-2-децилокси) пропиловый эфир 2', 3'-дидезокси-3'-фтор-5-хлоруридин)-5'-фосфорной кислоты,
2. /3-додецил-сульфинил-2-децилокси/ пропиловый эфир /3'-дезокси-3'-азидо-тимидин/-5'-фосфорной кислоты,
3. /3-додецил-сульфонил-2-децилокси/ пропиловый эфир /3'-дезокси-3'-ацидо-тимидин/-5'-фосфорной кислоты,
4. /3-додецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир /2',3'-дидезоксицитидин/-5'-фосфорной кислоты,
5. /3-додецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир /2', 3'-дидезоксиинозин/-5'-фосфорной кислоты,
6. /3-додецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир /2', 3-дидезоксигуанозин/-5'-фосфорной кислоты,
7. /3-додецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир /2', 3'-дидезоксиаденозин/-5'-фосфорной кислоты,
8. /3-додецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир /3'-дезокситимидин/-5'-фосфорной кислоты,
9. /3-додецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир /3'-дезокси-2', 3'-дидегидротимидин/-5'-фосфорной кислоты,
10. /3-додецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир /3'-дезокси-3'-фтортимидин/-5'-фосфорной кислоты,
11. /3-додецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир /2', 3'-дидезокси-3'-ацидогуанозин/-5'-фосфорной кислоты,
12. /3-додецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир /2', 3'-дидезокси-3'-фтор-2,6-диаминопуринрибозид/-5'-фосфорной кислоты,
13. /3-додецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир [2', 3'-дидезокси-2', 3'-дидегидро-N⁶-/2-метилпропил/-аденозин]-5'-фосфорной кислоты,
14. /3-додецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир [2',3'-дидезокси-2', 3'-дидегидро-N⁶-/o-метилбензил/- -аденозин]-5'-фосфорной кислоты,
15. /3-децилмеркапто-2-додециклоокси/ пропиловый эфир /2', 3'-дидезокси-2',3'-дидегидроцитидин/-5'-фосфорной кислоты,
16. /3-ундецилмеркапто-2-додецилокси/ пропиловый эфир /2', 3'-дидезокси-3'-фтораденозин/-5'-фосфорной кислоты,
17. /3-децилсульфонил-2-додецилокси/ пропиловый эфир /2', 3'-дидезокси-3'-ацидоуридин/-5'-фосфорной кислоты,
18. /3-децилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир /2', 3'-дидезоксицитидин/-5'-фосфорной кислоты,
19. /3-додецилмеркапто-2-додецилокси/ пропиловый эфир /2', 3'-дидезоксиинозин/-5'-фосфорной кислоты,
20. /3-тетрадецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир /3'-дезокси-3'-ацидотимидин/-5'-фосфорной кислоты,
21. /3-пентадецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир /3'-дезокси-3'-ацидотимидин/-5'-фосфорной кислоты,
22. /3-тридецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир /2', 3'-дидезоксиинозин/-5'-фосфорной кислоты,
23. /3-додецилмеркапто-2-октилокси/ пропиловый эфир /2', 3'-дидезоксиинозин/-5'-фосфорной кислоты.

Пример 1а. /3-Додецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир /3'-дезокси-3'-азидо'-тимидин/-5'-фосфорной кислоты.

К раствору из 1,25 г /3 ммол/ 3-додецилмеркапто-2- децилокси-1-пропанола и 1,2 мл /8,6 ммол/ триэтиламина в 40 мл абс. эфира, закапывали в атмосфере азота при 0^oC 0,42 мл /4,5 ммол/ POCl₃ и перемешивали в течение 45 мин. Затем нагревали до комнатной температуры, закапывали раствор из 800 мг /3 ммол/ 3'-дезокси-3'-азидо-тимидина /AZT/ в смеси из 15 мл абс. эфира и 20 мл абс. толуола и перемешивали в течение 6 ч при обратном потоке /тонкослойная хроматография - контроль/.

После охлаждения добавляли 50 мл воды, смесь интенсивно перемешивали в течение 2 ч, затем отделяли органическую фазу, высушивали над Na₂SO₄ и концентрировали в ротационном испарителе. Остаток подвергали очистке посредством препаративной хроматографии на колонке на силикагеле 60 с отношением дихлорметана/метанола 9:1 как растворителя. Выход составил 540 мг /24% от теоретической величины/.

Температура плавления 187^oC, спекание, температура разложения 220-223^oC при появлении коричневого окрашивания.

³¹p - ЯМР = 0,59 ppm .

Пример 1b. /3-Додецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир /3'-дезокси-3'-азидо-тимидин/-5'-фосфорной кислоты.

Аналогично прописи в Chem. Pharm. Bull. 36, 5020 /1988/, суспендировали 2 ммол. AZT и 5000 ед. фосфолипазы D в 4 мл буфера ацетата натрия / CaCl₂, разбавляли раствором из 6 ммол. монохолинового эфира 3-додецилмеркапто-2-децилоксипропил-1-фосфорной кислоты в 160 мл хлороформа и нагревали в течение 8 ч до 45^oC.

Затем высушивали над Na₂SO₄, а растворитель удаляли в вакууме. Остаток очищали, как описано в примере 1, посредством хроматографии на колонке. Выход составлял 51%. Продукт оказывался идентичным продукту из примера 1 a /температура плавления, DC, ¹H- и ³¹p - ЯМР/.

Пример 2. /3-Ундецилмеркапто-2-ундецилокси/ пропиловый эфир /3'-дезокси-3'-азидо-тимидин/-5'-фосфорной кислоты был получен аналогично примеру 1 a. Выход 27%, температура плавления 218-222^oC /разложение/.

Пример 3. /3-Додецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир /2', 3'-дидезокси-2', 3'-дидегидро-N⁶-/о-метилбензил/-аденозин-5'-фосфорной кислоты.

680 мг /1,37 ммол/ /3-додецилмеркапто-2-децилокси/ пропилового эфира фосфорной кислоты в 20 мл абс. пиридина разбавляли с помощью 337 мг /1 ммол/ 2', 3'-дидезокси-2', 3'-дидегидро-N⁶-/о-метилбензил/аденозина, и после добавления 1,37 г /6,7 ммол/ DCC помешивали в течение 24 ч при комнатной температуре /тонкослойная хроматография - контроль/. Затем удаляли в вакууме пиридин, остаток суспендировали в эфире и отфильтровывали от нерастворенной мочевины. Фильтрат после выпаривания растворителя подвергали очистке посредством хроматографии на колонке на силикагеле 60 с отношением дихлорметан /метанол 95/5 как растворителя. Выход 220 мг /26% теоретической величины/.

R_f = 0,68 /CH₂Cl₂/CH₃OH/H₂O 13/5/0,8/.

Пример 4. /3-Додецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир /3'-дезокси-3'-азидотимидин/-5'-фосфорной кислоты.

Аналогично примеру 3 из 13,5 /3-додецилмеркапто-2-децилокси/ пропилового эфира фосфорной кислоты, 5,5 г AZT и 27 г DCC в 350 мл абс. пиридина, в результате 30-часового перемешивания при комнатной температуре и очистке, как описано выше, получали соответствующий липонуклеотид с выходом 62% /аналитические данные идентичны данным, указанным в примере 1/.

Пример 5. /3-Додецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир /3'-дезокситимидин/-5'-фосфорной кислоты.

Аналогично примеру 3 из 1,3 г /3-додецилмеркапто-2-децилокси/ пропилового эфира фосфорной кислоты, 500 мг 3'-дезокситимидина и 2,6 г DCC в 40 мл абс. пиридина в результате перемешивания в течение 24 ч при комнатной температуре и хроматографической очистке получали соответствующий липонуклеотид с выходом 51%.

R_f = 0,45 /CH₂Cl₂/CH₃OH/H₂O 12/5/0,8/.

Пример 6. /3-Додецилмеркапто-2-децилокси/ пропиловый эфир /2', 3'-дидезоксиинозин/-5'-фосфорной кислоты.

Аналогично примеру 3 из 1,3 г /3-додецилмеркапто-2-децилокси/пропилового эфира фосфорной кислоты, 500 мг 2',3'-дидезоксиинозина и 2,6 г DCC в 40 мл абс. пиридина в результате 40-часового перемешивания при комнатной температуре и хроматографической очистке получали названный липонуклеотид, с выходом 61%.

R_f = 0,38 /CH₂Cl₂/CH₃OH/H₂O 13/5/0,8/.

Физические данные для получения соединений приведены в табл.1.

Примеры получения солей.

Пример 7. Получение сырого (3-додецилтио-2-децилокси) пропилового эфира продукта (3-дезокси-3-азидо-тимидин)-5 фосфорной кислоты.

509 г (0,95 моль) 3-додецилтио-2-децилокси-пропанол-1-монофосфата растворяют в 2,84 л сухого пиридина при комнатной температуре. Прибавляют 443 г (1,467 моль) триизопропил бензолсульфохлорида к раствору, затем 229 г (0,857 моль) 3 -дезокси-3-азидо-тимидина (АЗТ), спустя 10 мин при перемешивании при комнатной температуре все растворяется. Коричневый раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. После добавки воды смесь мутнеет, но при последующем перемешивании опять становится прозрачной. Раствор сгущают в вакууме при температуре бани 60^oC в ротационном испарителе и остаток дважды перегоняют с 2,8 л толуола до удаления пиридина. Полутвердый остаток после упаривания заливают 5,7 л диизопропилового эфира и перемешивают около часа на ледяной бане. Отсасывают пиридиновую соль триизопропилбензолсульфокислоты и промывают порциями 700 мл диизопропилового эфира. Соль сушат при 50^oC (615 г) и перекристаллизовывают. Эфирный фильтрат трижды встряхивают с 1,8 л 2н. HCl. Если не происходит хорошее разделение фаз, эмульсионный слой осторожно отсасывают на слое фибрина. Сушат органическую фазу сульфатом натрия и сгущают до постоянного веса. Получают 677 г сырого диэфира фосфорной кислоты (106% от теории, считая на 13 т) жидкостной хроматографией: около 76 поверхностного %.

Пример 8. Очистка сырого диэфира фосфорной кислоты путем образования соли Ca. 283 г (0,38 моль) сырого продукта по примеру 1 растворяют в 1,73 л метанола и 850 мл воды при перемешивании при комнатной температуре; прикапывают раствор 60,1 г ацетат-гидрата в 400 мл воды при перемешивании при комнатной температуре в течение 45 мин. Образуется мазеобразный осадок, который перемешивают длительное время (например, в течение ночи). При этом осадок становится порошкообразным. Кальциевую соль отфильтровывают и влажную интенсивно перемешивают с 1 л ацетона при комнатной температуре около 30 мин. Отфильтровывают и сушат. Выход 192 г.

Кальциевую соль суспендируют в 1,2 л метил-трет-бутилового эфира и 276 мл 2н. HCl и интенсивно перемешивают до разложения соли и образования слегка мутной водной фазы. После разделения фаз промывают метил-трет-бутиловую фазу дважды до 250 мл насыщенного раствора NaCl, сушат над сульфатом натрия и сгущают.

Остаток после выпаривания; 179,1 г (63,2% от введенного количества), жидкостная хроматография 90,41 пов.%.

Пример 9. Очистка сырого продукта препаративной жидкостной хроматографией.

Препаративная система:
стационарная фаза: Merck Lichroprep RP, 15-25 мк, подвижная фаза: 0,02 молярный раствор NaH₂PO₄ 12,5% + 87,5% метанола.

125 г сырого продукта по примеру 2 растворяют приблизительно при 35^oC в 750 мл метанола. Добавляют 1,5 л подвижной фазы и устанавливают значение pH= 5 концентрированной NaOH. Раствор фильтруют и фильтрат дополняют подвижной фазой до 2,5 л. Этот раствор хроматографируют порциями по 500 мл.

Фракционируют максимум основного продукта и отделяют фракцию в 1,2 л. Объединенные очищенные фракции из пяти разделений (6 л) сгущают в вакууме на роторном испарителе при температуре бани 40^oC до вязкого остатка. Остаток вымывают из аппарата порциями водой общим количеством 500 мл; устанавливают полуконцентрированной соляной кислотой значение pH=2.

Экстрагируют метил-трет-бутиловым эфиром (1·2 л; 2·1 л); фазы четко разделяются и могут быть слегка мутными. При третьей экстракции обе фазы, как правило, прозрачные.

Объединенные метил-трет-бутиловые экстракты для обезвоживания встряхивают дважды и 250 мл насыщенного раствора NaCl. Органическую фазу сушат над Na₂SO₄ и сгущают, жидкостная хроматография около 99,5 пов.%.

Пример 10. Получение Na-соли.

278,3 г (0,327 моль) очищенного хроматографией продукта по примеру 3 растворяют в 4,8 л метанола при комнатной температуре, смешивают с 760 мл воды (он становится молочным).

Устанавливают с помощью 1н. NaOH (около 300 мл) значение pH=5,8 по отношению к эталонному электроду и отфильтровывают мутный раствор. Прозрачный фильтрат сгущают в вакууме на ротационном испарителе. Остаток после упаривания четыре раза перегоняют с толуолом. Сухой остаток после выпаривания заливают 5,8 л ацетона и перемешивают около 1 ч при комнатной температуре. Отфильтровывают, промывают небольшим количеством ацетона и сушат при 50^oC.

Выход 278 г (97% от теории, считая на очищенную свободную кислоту), жидкостная хроматография 99,45 пов.%.

Пример 11. Получение Na-соли осаждением из раствора толуола.

3 г (0,0978 моль) очищенной свободной кислоты по примеру 3 растворяют в 500 мл толуола. Фильтруют слегка мутный раствор и смешивают с необходимым для образования соли количеством 30%-ного метилата натрия при перемешивании. Прозрачный слегка желтый раствор медленно прикалывают при перемешивании в 3 л ацетона. Перемешивают при необходимости в течение ночи, выпадает порошкообразный остаток. Его отфильтровывают, промывают ацетоном и сушат слегка клейкий продукт при 50^oC. Выход 66,2 г (88,1% от теории).

Ниже приводятся соединения, полученные аналогично примеру 7 в виде сырого продукта, обогащены через кальциевую соль аналогично примеру 8, очищены аналогично примеру 9 препаративной жидкостной хроматографией и перевода в натриевую соль аналогично примеру 11:
1. натриевая соль (3-ундецилмеркапто-2-ундецилокси) пропилового эфира (3'-дезокси-3'-азидотимидин)-5'-фосфорной кислоты, т.пл. 218-222^oC с разл., R_f=0,55 (изопропанол:бутилацетат:вода = 5:3:2);
2. натриевая соль (3-додецилокси-2-децилокси) пропилового эфира (3'-дезокси-3'-азидотимидин)-5'-фосфорной кислоты, т.пл. 205-211^oC с разл, R_f=0,60 (изопропанол:бутилацетат:вода = 5:3:2);
3. натриевая соль (3-децилмерконато-2-додецилокси) пропилового эфира (3'-дезокси-3'-азидотимидин)-5'-фосфорной кислоты, т.пл.>206^oC с разл.; R_f= 0,24 (метанол:вода = 8:2);
4. натриевая соль (3-децилмерканто-2-децилокси) пропилового эфира (3'-дезокси-3'-азидотимидин)-5'-фосфорной кислоты, т.пл.>207^oC с разл, R_f=0,45 (изопропанол:бутилацетат:вода = 5:3:2);
5. натриевая соль гексадецилового эфира (3'-дезокси-3'-азидотимидин)-5'-фосфорной кислоты, т.пл. 227-230^oC с разл, R_f = 0,55 (изопропанол:бутилацетат:вода = 5:3:2);
6. натриевая соль (3-тетрадицилмерконто-2-децилокси) пропилового эфира (3'-дезокси-3'-азидотимидин)-5'-фосфорной кислоты, т. пл. 155^oC, R_f=0,30 (уксусный эфир:метил = 3:1;
7. натриевая соль (3-додецилмерканто) пропилового эфира (3'-дезокси-3'-азидотимидин)-5'-фосфорной кислоты, т.пл.>200^oC с разл; R_f=0,20 (уксусный эфир:метанол = 3:1);
8. натриевая соль (3-додецилмерканто-2-додецилокси) пропилового эфира (3'-дезокси-3'-азидотимидин)-5'-фосфорной кислоты,
т.пл.>170^oC с разл, R_f=0,25 (уксусный эфир:метанол = 3:1);
9. натриевая соль (3-децилмерканто-2-гексадецилокси) пропилового эфира (3'-дезокси-3'-азидомидин)-5'-фосфорной кислоты, т. пл. 135^oC, R_f= 0,35 (уксусный эфир:метанол = 3:1);
10. натриевая соль (2-додецилокси) тетрадецилового эфира (3'--дезокси-3'-азидотимидин)-5'-фосфорной кислоты, т.пл. 83^oC, R_f=0,35 (уксусный эфир: метанол = 3:1);
11. натриевая соль (3-тридецилмерканто-2-децилокси) пропилового эфира (3'-дезокси-3'-азидотимидин)-5'-фосфорной кислотыж; т.пл.>190^oC с разл, R_f= 0,20 (уксусный эфир:метанол = 3:1);
12. натриевая соль (3-додецилмерканто-2-октилокси) пропилового эфира (3'-дезокси-3'-азидотимидин)-5'-фосфорной кислоты; т.пл.>200^oC с разл, R_f= 0,60 (метиленхлорид:метанол:вода = 65:25: 4)^*;
13. натриевая соль (3-ундецилмерканто-2-децилокси) пропилового эфира (3'-дезокси-3'-азидотимидин)-5'-фосфорной кислоты; т.пл.>200^oC с разл, R_f= 0,25 (уксусный эфир:метанол = 3:1);
14. натриевая соль (3-додецилмерканто-2-децилокси) пропилового эфира (3'-дезокси-тимидин)-5'-фосфорной кислоты, т. пл. >175^oC с разл, R_f=0,45 (изопропанол:бутилацетат:вода = 5:3:2);
15. натриевая соль (3-додецилмерканто-2-децилокси) пропилового эфира тимидин-5'-фосфорной кислоты, т.пл. 251-254^oC с разл, R_f=0,45 (н-пропанол:вода = 9:1);
16. натриевая соль (3-додецилмерканто-2-децилокси) пропилового эфира (6-меркантопурин-9-β-D-рибофуранозид)-5'-фосфорной кислоты, т.пл.> 200^oC разл, R_f=0,45 (изопропанол:бутилацетат:конц.аммиак:вода = 50:30:5:15);
17. натриевая соль (3-додецилмерканто-2-децилокси) пропилового эфира (5-флуоруредин)-5'-фосфорной кислоты, т.пл.>210^oC разл, R_f=0,55 (метиленхлорид:метанол:вода = 65:25:4);
18. натриевая соль (3-дедоцилмерканто-2-децилокси) пропилового эфира (2', 3'-дидезокси-цитидин)-5'-фосфорной кислоты, т.пл. 202-205^oC разл, R_f= 0,50 (изопропанол:бутилацетат:вода = 5:3:2);
19. натриевая, соль(3-ундецилмерканто-2-ундецилокси) пропилового эфира (3'-дезокси-3'-фтортимидин)-5'-фосфорной кислоты, т. пл.>200^oC с разл, R_f= 0,15 (дихлорметан:метанол = 8:2);
20. натриевая соль (3-додецилмерканто-2-децилокси) пропилового эфира 2'-(9- { /(1-гидроксиметил)этокси/метил} гуанидин)-фосфорной кислоты, т.пл. >170^oC с разл, R_f=0,22 (изопропанол:бутилацетат:вода:конц.аммиак = 50:30:15: 5);
21. натриевая соль (3-додецилмерканто-2-децилокси) пропилового эфира 2'-(9{ /(1-гидроксиметил)этокси/метил} гуанин)-фосфорной кислоты, R_f= 0,73 (вода:метанол 0,5:9,5 на RP-8), R_f=0,30 (дихлорметан:метанол:вода = 6,5:2,5: 0,4 на силикагеле;
22. натриевая соль (3-додецилмеркапто-2-децилокси) пропилового эфира 2'-/9-(этоксиметил)гуанин/-фосфорной кислоты, R_f=0,77 (вода:метанол = 0,5: 9,5 на RP-8), R_f=0,35 (дихлорметан:метанол:вода = 6,5:2,5:0,4 на силикагеле).

Рецептура.

BM 21 1290 а (соединение по примеру 1a), тонкоразмолотое, перемешивают в турбосмесителе с указанным в табл. 2 количеством лактозы и заполняют твердые желатиновые капсулы размером 0.

Эффективность и переносимость АЗТ и соединения примера 1a настоящей заявки (с. пр. 1a) на модели лейкоза, вызванного вирусом Friend (BF)
1) Материалы и методы.

Самок мышей в возрасте 6-8 недель заражали на 0 день 0,2 мл экстракта клеток селезенки, содержащих вирусы. Животным вводили ежедневно от 0 дня (начало: 1 ч после заражения) до 13 дня 3'-дезокси-3'-азидотимидин (АЗТ) и (3-додецил-тио-2-децилокси)-пропиловый эфир (3'-дезокси-3'-азидотимидин-5'-фосфорной кислоты (с. пр. 1a) в дозах, указанных в табл. 3 и 4. До начала терапии и на 13 день определяли вес тела и формулу крови, а также на 14 день - после умерщвления - определяли вес селезенки в качестве парамера вирусемии.

2) Результаты.

Табл. 3 и 4 демонстрируют дозозависимый эффект АЗТ и с. пр. 1a на увеличение селезенки, вызванное вирусами (табл. 3) или на восстановление вирус-зависимой супрессии насыщенности клетками костного мозга, соответственно (табл. 3).

Данные табл. 3 и 4 свидетельствуют о том, что соединение примера 1a более эффективно, чем АЗТ.

Следующие результаты представляют отношения между активностью и молекулярной структурой заявленных эфиров нуклеотида и липида.

Эти результаты были получены при различных сочетаниях в двух сериях на модели лейкоза, названного вирусом Friend, in vitro. Эти результаты сравнивали с результатами, полученными для АЗТ или в контроле, соответственно.

1. В настоящем документе испытуемые соединения обозначаются внутренним номером заявителя. Из табл. 5 ясно к каким соединениям относятся эти номера.

2. Серия 1: отношения между активностью и молекулярной структурой эфирного липидного (ЭЛ) нуклеозида на модели лейкоза, вызванного вирусом Friend in vitro.

а) постановка экспериментов:
самок мышей BaIb/c (возраст 7-9 недель, от Iffa Credo, Бельгия) заражали на 0 день эксперимента 0,2 мл разведенного 1:10 (ФСБ) ВГ и от +3 до +13 дня ежедневно один раз в день вводили им интраперитонеально вещества, перечисленные в табл. 6 (доза: 50 мг/кг/день) или ФСБ (фосфатно-солевой буферный раствор) (контроль I и II). На +14 день всех животных умерщвляли. Количество животных в каждом эксперименте равнялось 10 (n = 10).

б) Исследования.

На +13 день, т.е., когда терапия была закончена, исследовали малую картину крови, состоящую из восьми различных гематологических параметров, с помощью стандартных методик. После умерщвления животных на +14 день определяли вес селезенки.

с) Результаты (см. табл. 6).

ca) В табл. 4 представлены величины медианы для веса селезенки и количества тромбоцитов. Вес селезенки на +14 день после заражения вирусом Friend коррелирует с вирусемией и представляет собой параметр заболевания, который можно легко измерить. По результатам всех проведенных исследований можно сделать вывод о том, что количество тромбоцитов в периферической крови, которое также очень легко подсчитать, также является параметром вирусемии, который коррелирует с ней и с весом селезенки, соответственно.

cb) Как видно из табл. 4, заявленные соединения, содержащие АЗТ в качестве нуклеозида, активны в отношении вирусемии. Результаты свидетельствуют также о том, что существует связь между активностью и молекулярной структурой испытанных конъюгатов ЭЛ-нуклеозидов in vitro. Определяются следующие тенденции (стрелки указывают понижение активности):
cba) BM 21.1291 (C₁₁/C₁₁) _→ BM 21.1290 (C₁₂/C₁₀) BM 21.1388 (C₁₀/C₁₂)
cbb) BM 21.1290 (S) _→ BM 21.1380 (SO) _→ BM 21.1384 (SO₂)
coc) BM 21.1290 (АЗТ) _→ BM 21.1365 (ддИ)
Как показывает (cbc), заявленные соединения, содержащие ддИ в качестве нуклеозида, менее активны, чем соединения, содержащие АЗТ, тем не менее испытанное соединение (BM 21.1365) активно так же, как АЗТ (вес селезенки больше, количество тромбоцитов больше), в то время как для этого соединения побочные токсические эффекты на костный мозг, наблюдающиеся для АЗТ, не ожидаются.

Сравнение: вес селезенки здоровой, не инфицированной и нелеченной мыши BaIb/c, в норме 0,1-0,2 г. Количество тромбоцитов в норме составляет около 600-800·10 μл.

3. Серия 2: влияние АЗТ, BM 21.1290 и некоторых других конъюгатов ЭЛ-АЗТ (включая R/S - BM 21.1290) на течение лейкоза, вызванного вирусом Friend, у мышей BaIb/c (частичное повторение предыдущих экспериментов).

а) Постановка экспериментов (смотри 2.a).

b) Измеренные параметры:
ba) вес тела на 0 и +13 дни,
bb) ОТ (обратная транскриптаза) на 0 и +14 дни (ОТ на 0 день только проверочно, 1 животное из группы) (после умерщвления животных отделяли сыворотку индивидуально и замораживали при -70^oC для определения ОТ),
bc) малая картина крови на 0 и +13 дни (картина крови на 0 день только проверочно, 1 животное из группы),
bd) вес селезенки на +14 день.

с) Результаты представлены в табл. 7-9.

В каждой таблице даны необходимые пояснения, включая найденные значимые различия между испытанными группами.

Формула изобретения

1. Фосфолипидные производные нуклеозидов общей формулы I

где R₁ линейный или разветвленный алкил С₈ - С₁₅;
R₂ линейный или разветвленный алкил С₈ - С₁₅;
n 0, 1 или 2,
группа

является -2', 3'-дидезоксиинозином, -2,3'-дидезоксицитидином, -3'-дезокситимидином, -2', 3'-дидезокси-2', 3'-дидегидро-N⁶-(O-метилбензил)-аденозином, -3'-дезокси-3'- фтортимидином или -3'-дезокси-3'-азидотимидином,
или их таутомеры, или физиологически приемлемые соли неорганических или органических кислот или оснований.

2. Соединения по п.1, где R₁ C₁₀ - C₁₄-алкил.

3. Соединения по пп.1 или 2, где R₂ C₈ - C₁₂-алкил.

4. Фосфолипидные производные нуклеозидов формулы I по пп.1 3, где группа

является остатком, выбранным из -2',3'-дидезоксиинозина, -2',3'-дидезоксицитидина, -3'-дезокситимидина, -2', 3'-дидезокси-2',3'-дидегидро-N⁶- (O-метилбензил)-аденозина, -3'-дезокси-3'-фтортимидина, 3'-дезокси-3'-азидотимидина.

5. Фармацевтическая композиция, ингибирующая вирусную обратную транскриптазу, содержащая в качестве активного начала фосфолипидные производные нуклеозидов и фармацевтически приемлемый носитель и вспомогательную добавку, отличающаяся тем, что в качестве фосфолипидных производных нуклеозидов используют соединения по п.1, в эффективном количестве.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 15.08.2009

Извещение опубликовано: 20.07.2010        БИ: 20/2010

---