Способ получения фермента на полимерной матрице

 

k г, ", г .:@@ е6 1 но--,,„;,„, О П ИСТАЙ И Е

ИЗОБРЕТЕН Ия (11)425936

Сбюз Сойетскмх

Сощиапистнческих

Республик

К АВТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Зависимое от авт. свидетельства— (22) Заявлено 17.05.72 (21) 1784072/28-13 с присоединением заявки Ме— (32) Пр нор итет—

Опубликовано 30.04.74. Бюллетень Ме 16

Дата опубликования описания 10.03.75 (51) М. Кл. С 12d 13/10

С 07g 7/02

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретеиий и открытий (53) УДК 577 15.08 (088.8) (72) Авторы и,зобретен ия

В. М. Беликов, А. К. Овчаров, Л. C. Слободяникова, В, К. Латов и М. О. Рожанский (71) Заявитель Ордена Ленина институт элементоорганических соединений (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА

НА ПОЛИМЕРНОЙ МАТРИЦЕ

Изобретение относится к области технической биохимии, а именно к способам получения ферментов на полимерной матрице.

Известен способ получения ферментов на полимерной матрице, путем смешивания сополимера и раствора фермента и выдерживания полученной смеси при перемешивании с последующей промывкой полученното осадка.

Из-за нерастворимости исходных полимеров в водной среде такой способ длителен.

Кроме того, частичный гидролиз полимерных реакционноспособных групп, например ангидридных, снижает эффективность процесса, при этом получаемые фермент-полимерные препараты имеют низкую ферментативную активность.

Целью изобретения является сокращение времени на реакцию связывания фермента с матрицей.

Для этого сополимер и фермент перед смешиванием растворяют в апротонном диполярном растворителе, а после выдерживания в смесь вводят водный раствор кислоты.

При этом из растворов кислот используют раствор соляной кислоты.

Кроме того, в водный раствор соляной кислоты вводят соли поливалентных металлов, например хлорное железо.

При этом из апрото нных диполярных растворителей иапользуют длметилсульфоксид, а также диметилформамид.

Предлагаемый способ осуществляют следующим об разом.

Сополимер стирола и раствор фермента растворяют в апротонном диполярном растворителе, например в диметилсульфоксиде илн диметилформамиде, а затем их смешивают.

Полученную смесь выдерживают при переме1О шивании, после чего в смесь вводят водный раствор соляной кислоты и соли поливалентных металлов, например хлорное железо.

Осадок отделяют цвнтрифугированием и промывают дистиллированной водой для удаления непрореагировавших веществ, после чего его высушивают в вакууме при комнат.ной температуре.

Пример 1, К 20 мл 5 / -го раствора со полимера стирола и малеинового ангидрида (1 г) в,ди мет нлсульфоксиде дооавляют 20 .чл

10% -го раствора «Протосубтилина ГЗХ-1» (2 г) в,диlметилlcулbфolкcиде, тередставляющего собой ферментный препарат, полученный из культуральной жидкости Вас. subtilis. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение часа и затем образовавшийся фермент-полимерный комплекс осаждают 100 лл 0,01 н. соляной, кислотой, Осадок отделяют центрифугированием и промывают дистиллированной водой, удаляя непро425936

Предмет изобретения

Заказ 73/247 Изд. № 1569 Тираж 456 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, 7Ê-35, Раушская наб., д. 4/5

Тип. Харьк. фил. пред. «Патент» реагировавшие вещества. Затем осадок высушивают в вакууме при комнатной температуре, получая 1,6 г фермент-,полимерного препарата с содержнаием белка 15%.

Суммарная протеолитическая активность полученного препарата составляет 2,8X10 ед.

Удельная протеолитическая активность составляет 70%.

Пример 2. К 20 мл 10%-ro раствора сополимера стирола добавляют 20 мл 5%-го раствора «Протосубтилина ГЗХ-1» (1 г) в диметилформамиде, реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение часа и затем добавляют 50%-ный раствор

FeCI> (500 мг), рН реакционной среды доводят до 4,0 добавлением 0,01 н. соляной кислоты, выдерживают 30 мин при перемешивании и образовавшийся осадок отделяют центрифугированием. Осадок тщательно промьввают дистиллированной водой и затем холодным этанолом при минус 10 С и высушивают в вакууме при комнатной температуре.

При этом получают 2,4 г фермент-полимерного препарата с 12 /о содержанием белка.

Суммарная протеолитическая активность препарата составляет 1,2Х10 ед. Выход по протеолитической активности составляет 600 .

Пример 3. К 7 мл 5%-ного раствора сополимера этилена и малеинового ангидрида (0,3 г) в диметилсульфоксиде добавляют 7 мл

10% -ного раствора «Протосубтилина ГЗХ-1» (0,7 г) в диметилсульфоксиде.

Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение часа и затем добавляют 100 мл 0,005 н. соляной .иислоты.

Смесь выдерживают 30 мин при комнатной температуре. Образовавшийся осадок отделяют центрифу гированием и тщательно промывают водой и холодным этанолом при минус

10 С, получая 0 3 г фермент-полимерного комплекса с 30 содержанием белка. Суммарная протеолитическая активность препарата соста вляет 0,29Х10 ед.

Удельная протеолитическая активность полученного препарата 13000 ед/мг белка.

Выход по протеолитической активности составляет 30 /о.

Пример 4. К 5 мл 2%-ного раствора

«Протелина» (0,1 г) — ферментного препара та из культуральной жидкости str. griscus в диметилсульфоксиде — добавляют 1 мл 10% ного раствора сополимера стирола и малеиново|го анги1дри да (0,1 г) в диметилсульфоисиде. Реа кц ионную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение часа и затем добавляют 50 мл 0,01 н. соляной кислоты, содержащей 1 мл 50 /в-ното раствора сеС13 (500 мг).

Смесь выдерживают 30 мин при комнатной температуре и интенсивном перемешивании. Образовавшийся осадок фермент-полимерного комплекса отделяют центрифугированием, тщательно промывают водой и холодным этанолом и высу шива1от в вакууме при комнатной температуре, получая 0,08 г фермент-полимерного препарата с содержанием

25% белка. Суммарная протеолитическая активность составляет 5500 ед/иг белка. Выход по протеолитической активности составляет

56 /,.

Для коагуляции фермент-полимерного комплекса используют также серную кислоту.

Пример 5. К 20 мл 10%-,ного раствора сополимера стирола и малеинового ангидрида в диметилсульфоксиде добавляют 20 мл

50 -ного раствора «Протосубтилина ГЗХ-1» в диметилоульфоксиде.

Реакционную смесь перемешивают в течение часа и образовавшийся фермент-полимер ный ксл(плек с осаждают 100 мл 0,01 н. серной кислоты. Осадок отделяют центрифугированием, промывают дистиллированной водой и холодным этанолом при минус 40 С и высушивают в вакууме при комнатной температуре, получая 2,5 г фермент-полимерного препа рата с содержанием белка 11%.

Суммарная протеолитическая активность составляет 1,1X10 ед, Выход по протеолитической активности составляет 55%.

1. Способ получения фермента на полимерной мач1р ице путем смешивания сополимера и раствора фермента и выдерживания полученной смеси при перемешивании с последующей промывкой полученного осадка, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени на реакцию связывания фермента с матрицей, сополимер и фермент перед смешиванием растворяют в апротонном диполярном растворителе, а после выдерживания в смесь вводят водный раствор кислоты.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что из растворов кислот используют раствор соляной кислоты.

l3. Способ по пп. 1 — 2, отличающийся тем, что в водный раствор соляной кислоты вводят соли пол ивалентных металлов, например хлорное железо.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что из апротонных диполярных растворителей используют диметилсульфоксид.

5. С по соб по и. 1, отличающийся тем, что из апротонных диполярных растворителей используют диметилформамид.