Способ получения стимулятора интерферопа

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ пщ 43368 8

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительный к патенту (51) N. Кл.2 С 12К 7/00 (22) Заявлено 20.03.72 (21) 1762525 31-16 (23) Приоритет — (32) 22.03.71 (31) 15825 (33) Япония

Государственный комитет

Совета Министров СССР (53) УДК 615.371(088.8) (43) Опубликовано 25.06.74. Бюллетень ¹ 23 (45) Дата опубликования описания 30.01.78 по делам изобретений и OTlipblTHH (72) Автор изобретения

Иностранец

Ясукие Накасе (Япония) Иностранная фирма

«Китасато Институт» (Япония) (71) Заявитель

2 организма вида Bordetella pertusis в I фазе р азвития.

Вышеупомянут) ю активную фракцию А концентрируют до 50 мл, затем концентрат

5 подвергают очистке хроматографическим путем с применением раА3-Сефадекса А-50 и получают 50 мл активной фракции. Аналогпчноп оораоотке подвергают активные фракции

ВиС,.

ip lip имер 2. Микроорганизмы вида Borde(e! Iа pertusis в ill фазе развития культивируют при 3э — 3/ С в течение 48 часов в угольно-агаровой среде. Затем 10 r микробных клеток сооирают и суспендируют в 100 мл в со15 левом фосфатном буферном растворе, полученную суспензию подвергают в течение 30 минут звуковой обработке (10 кгц) с целью измельчения микрооных клеток. Затем жидкость, содержащую измельченные микробные

2р клетки, центрифугируют. 90 мл верхнего слоя жидкости оораоатывают хроматографическим путем с применением Сефадекса Ы 1оО, получают 40 мл активной фракции D-1. Аналогично методике, приведенной выше, культивируют микроорганизмы вида Bordetella pertus>s в

111 фазе развития при 35 — 37 С в течение 72 часов, получая 40 мл активной фракции D-2.

Аналогичным образом получают 40 мл активной фракции Е с применением мпкрооргаИзобретение относится к области медицины.

Известен способ получения стимулятора интерферона из микроорганизмов путем выращивания их на жидкой или твердой питательной среде, выделения основных фракций дезинтеграфией, ультрафильтрацией и хроматографией.

Целью предложенного изобретения является повышение активности препарата.

Для достижения поставленной цели в качестве исходного сырья используют микроорганизмы типа Bordetella pertusis в 1, I I u Ill фазе развития.

Пр и мер 1. Микроорганизмы вида Bordctella pertusis в III фазе развития подвергают взбалтыванию прп 35 — 37 С в течение 72 часов в модифицированной культуральной среде

Кохена-Вилера. После культивирования культуральную жидкость центрифугируют с получением 1,000 мл надосадочной жидкости, которую фильтруют в стерильных условиях, в результате чего получают 900 мл активной фракции А.

Аналогичным образом получают 900 мл активной фракции В при использовании микроорганизма вида Bordetella pertusis во II фазе развития.

Аналогичным образом получают 900 мл активной фракции С при использовании микро(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА ИНТЕРФЕРОНА

433688 низма вида Bordetella pertusis во II фазе развития.

Описанным выше способом получают 40 мл активной фракции F с применением микроорганизма вида Bordetella pertttsis I фазы развития. Затем жидкость, содержащую измельченные микробные клетки фазы 1, цептрифугируют и получают верхний слой жидкости, которую затем подвергают хроматографической очистке с применением ДЭАЭ-целлюлозы в качестве адсорбента, в результате чего получают 30 мл активной фракции G.

Результаты изучения получения пптерферона из активных фракций А вЂ, полученных по методикам примеров 1 и 2, приведены ниже со ссылкой на следующие сравнительные примеры.

Сравнительный пример 1.

Определение количества вырабатываемого интерферона (опыты in vitro) .

Смешанный раствор, содержащий 1,4 объемных частей солевого фосфатного буферного раствора и 1 объемную часть раствора РинТаблица 1

Оценка вырабатываемости интерферона (в опытах in vitro) Титр интерферона

Концентрация образца

Образец

Клетки селезенки

Клетки лимфатических узлов разбавление

10-кратное

100-кратное

1000-кратное

100-кратное

1000-кратное

10000-кратное

100000-кратное

100-кратное

1000-кратное

10000-кратное

100000-кратное

100-кратное

1000-кратное

220

100

230

220

300

100-кратное

1000-кратное

106

930

20- кратное

100-кратное

500-кратное

Содержит 10 мг твердых частиц на 1 мл (необработанный)

Обработанный при

56 С в течение 30 мин

17

52

72

240

1400

1900

10-кратное разбавление жидкости, содержащей

45 мг твердых частиц на 1 мл

720

630

1900

50-кратное разбавление указанной жидкости

250- кратное разбавление указанной жидкости

230

1. Фаза 111 микроорганизма Bordetella pertusis (1) Верхний слой культуральной жидкости (активная фракция) (2) Верхний слой измельченных микробных клеток, 48-часовая культура (активная фракция D — 1) (3) Верхний слой измельченных микробных клеток, 72-часовая культура (активная фракция D — 2) 2. Фаза 11 микроорганизма Bordetella pertusis (1) Верхний слой культуральной жидкости, 72-часовая культура (активная фракция B) (2) Верхний слой культуральной жидкости, 48-часовая культура (активная фракция E) 3. Фаза 1 микроорганизма Bordetella pertusis (1) Верхний слой культуральной жидкости (активная фракция С) (2) Верхний жидкий слой измельченных микробных клеток (актпвная фракция F) (3) Некротоксин (активная фракция G) гера, смешивают с 0,6 объемными частями телячьей сыворотки, полученную смесь смешивают с 3 объемными частями дистиллированной воды с получением гипотонического

5 раствора. Каждую из активных фракций А — G разбавляют указанным гипотоническим раствором до различных концентраций с получением разбавленных образцов. С другой стороны приготовляют клеточную суспензию таким

10 образом, чтобы ткани селезенки и лимфатических узлов кролика весом 500 — 1000 г, убитого проколом в сердце, были разорваны с помощью пинцета, и полученные клетки суспсндируют в культуральной среде до концен15 трации 5 10 клеток на одну чашку (для селезенки и лимфатических узлов). Затем каждый из вышеуказанных разбавленных образцов смешивают с вышеупомянутой клеточной суспензией и культивируют при 25 С в течение

20 24 часов, культуральную жидкость центрифугируют с получением верхнего слоя жидкости, который затем подвергают оценке на вырабатываемость интерферона. Полученные результаты приведены в таблице 1.

433688

Титр интерферона выражается в отношении наивысшего разбавления, вызывающего 50% ингибирование количества и размеров кровяных пластинок по сравнению с контролем.

Сравнительный пример 2.

Оценка вырабатываемости интерферона (в опытах in vitro).

Каждый из разбавленных образцов, полученных по методике сравнительного примера

Таблица 2

Оценка вырабатываемости интерферона (B опытах 1п vftro) Титр интерферона

Номер кролика

Образец

Концентрация образца через

2 часа через

5 часов

Разбавление

10-кратное

1800

210

20-кратное

100-кратное

500-кратное

Содержит 10 мг твердых частиц на 1 мл (необработанный)

Обработанный при

56 С в течение 30 мии

1200

1250

500 мг/кг веса (необработанный) Обработанный при

56 С в течение 30 мин

340

43 менее 10

Предмет изобретения

Способ получения стимулятора интерферона из микроорганизмов путем выращивания их на твердой или жидкой питательной среде с последующей дезинтеграцией, ультрафильтраСоставитель С. Щенева

Техред P. Юсупова

Редактор Н. Белявская

Корректор А. Степанова

Заказ 199/14 Изд. № 165 Тираж 451

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, К-35, Раушская наб., д. 4,5

Подписное

Типография, пр. Сапунова, 2

1. Фаза III микроорганизма Bord. per.

Верхний слой культуральной жидкости (активная фракция А) 2, фаза I,м икроорганиз,ма Bord. рег. (1) Верхний слой культуральной жидкости (активная фракция С) (2) Верхний слой измельченных микробных клеток (активная фракция F) (3) Некротоксин (активная фракция G) 1, вводят в дозировке 0,5 мл путем внутривенного введения кроликам весом от 500 до

1000 г. На 2-й и 5-й час после инъекции отбирают по 3 мл крови у каждого кролика посредством прокола сердца, и сыворотку, выделенную из указанной крови, подвергают оценке на вы раб атываем ость интер ферона, аналогично методике сравнительного примера

1. Полученные результаты приведены в таб10 лице 2.

15 цией и хроматографией, отл и ч а юшийся тем, что, с целью увеличения активности препарата, в качестве исходного сырья используют микроорганизмы типа Bordetella pertusis в

I, II u III фазе развития.