Способ получения l-лизина

 

О П И СА Н---И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ (») 440 848

Союз Советских Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (61) Зависимый от патента (22) Заявлено 27.02.70 (21) 1408967/28-13 (51) М. Кл. С 12d 13/06 (32) Приоритет 27.02.69 (31) 14776/69 (33) Япония

Опубликовано 25.08.74. Бюллетень № 31

Гобкдарствеинык комитет

Совета Министров СССР (53) УДК 663.14(088.8) по делам изобретений и открытий

Дата опубликования описания 29.04.75 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Синдзи Окумура, Фумихиро Йосинага, Ясухико Йосихара, Акира Камимура и Тадауки Кадзивара (Япония) Иностранная фирма

«Аджиномото Ко, Инк» (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА

Изобретение относится к микробиологической промышленности.

Известен способ получения L-лизина путем культивирования продуцирующих его микроорганизмов Brevibacterium на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода и азота ацетатные ионы и необходимыс для синтеза питательные соли с последующим выделением L-лизина.

Предлагаемый способ увеличивает выход аминокислоты.

Достигается это тем, что из рода Brevibacteг1пт используют штамм flavum АТСС 21129.

При этом концентрацию ионов ацетата в среде поддерживают равной 1,5 вес. %, а рН среды 7,0 — 8,5.

Для получения L-лизина из культуральной среды по предлагаемому способу в качестве источника углерода используют соли уксусной кислоты, такие как ацетат калия, ацетат натрия, ацетат аммония и ацетат кальция, или уксусную кислоту, а в качестве источника азота — мочевину, аммиак или соли аммиака, такие как хлористый аммоний, сульфат аммония и карбонат аммония.

Ацетат аммония применяют в качестве вещества, которое одновременно служит источником углерода и азота.

Кроме источников углерода и азота добавляют сооответствующее количество минеральных составляющих, витаминов или витаминосодержащих веществ для окончательного формирования среды. В качестве таких веществ используют витамины Вь биотин, дрожжевые экстракты, жидкость после вымачивания зерна, белковый гидролизат из соевых бобов, рыбную муку, вываренную рыбную муку, 10 гидролизат казеина.

Микроорганизмы, которые способны к выделению L-лизина в среде, содержащей ацетатные ионы в качестве источника углерода, широко распространены. Такие микроорганизмы

15 получают в виде мутантов, имеющих определенные биохимические характерные особенности, которые известны в процессах ферментативного получения L-лизина, использующего карбогидраты в качестве основного источшл а

20 углерода.

Микроорганизмами, которые могут продуцировать L-лизин, используя ацетатные ионы в качестве основного источника углерода, является например: Brevibacterium f1 avum, 25 ВгеиЬас1ег1птп lactofermentum, Brevibacicrium

ammoniagenes, Corynebacterium acetoacidophilum, Micrococcus glutamicus u Arthrobachter

atreus, 440848

Гидр олизат крахмала (рассчитанный по глюкозе)

Ацетат аммония

КН2Р04

Мд$04 ° 7Н20

Fe++

Мп++

Белковый гидролизат из соевых бобов

1,5 /о

0,3 о/

0,1 о/, 0 04 о/о

2 ppm

2 ррт

3 ppm

Способ заключается в следующем.

На первой стадии микроорганизмы высевают на исходную среду, содержащую вместе с ацетатными ионами в количестве меньше 4о/о (предпочтительно менее 2о/о) и проводят аэробное выращивание микробов при перемешивании.

Так как прибавленные в начале ацетатные ионы в исходной среде ассимилируются,по мере инкубации, в среду во время выращивания бактерий непрерывно или периодически вводят ацетатные ионы вместе с источником азота. Введение ацетатных ионов во время культивации ведут так, чтобы концентрация ацетатных ионов в среде не превышала 1,5 /о, и чтобы значение рН культивируемой среды было от 7 — 8,5.

Для установления концентрации ацетатных ионов и рН в среде используют раствор из смеси уксусной кислоты и ацетата аммония соответственно 1: 0,5 — 0,75, предпочтительно

1: 0,1 — 0,5.

Когда раствор из смеси с указанным молярным соотношением подают в среду, поддерживая в ней значение рН между 7,0 — 8,5, концентрация ацетатных ионов в среде не превышает 1,5 вес. /о. Если содержание ацетата аммония в растворе смеси больше этих значений, концентрация остаточной уксусной кислоты в культуральной среде увеличивается и соответственно продуцирование L-лизина замедляется. И наоборот, когда это содержание меньше, соотношение между углеродом и азотом в среде становится неподходящим для продуцирования L-лизина.

В тех случаях, когда источник азота, такой как газообразный аммиак, водный раствор и мочевину подают отдельно, проверяют рН среды для того, чтобы оно имело значение между 7 и 8,5 и концентрацию ацетатных ионов для получения хорошего выхода L-лизина.

Для увеличения выхода L-лизина в культуральную среду вводят карбогидраты вместе с ацетатными ионами в виде их смеси. Общее количество добавляемых в среду карбогидратов во время ферментации находится в пределах 20 /о (предпочтительно 5 15 /0), исходя из расчета общего количества ацетатных ионов, добавляемых в среду.

Извлечение L-лизина из питательной среды ведут известными способами, например при помощи ионообменных смол.

Пример 1. Brevibacterium flavum АТСС

21129 высевают на культуру (рН 8) следующего состава:

0,7%

0,2%

0,04 /о

DL-метионин 10 мг/дл

Биотин 50 у/л

Витамин В НС1 200 у/л, Инкубацию ведут в течение 11 час при

31,5 С в аэробных условиях.

Основную культуральную среду вводят в стеклянные ферменторы-качалки небольшого размера порциями по 300 мл. Все порции стерилизуют при 110 С в течение 10 мин, 1р Основная культуральная среда (рН 6,5) имеет следующий состав:

Ацетат аммония l 2o/

КН2РО4 0,2 /.

MgSO4 7Н20 0 04 о/о

Fe++ 2 ppm

Мп++ 2 ррт

Белковый гидролизат из сое- 4 мл/дл вых бобов

L-треонин 15 мг/дл

DL-метионин 30 мг/дл

Биотин 50 у/л

Витамин В НС1 40 у/л

Мочевина 0,2 о/о

15 мл обсемененного,питательного бульона добавляют к основной культуральной среде в ферменторе и ведут инкубацию при 31,5 С, перемешивая среду со скоростью 1350 об/мин при аэрации в том же объеме в 1 мин, что и для бульона. После 5 час,культивирования значение рН культуральной среды становится равным приблизительно 8,2. Автоматически подают водный раствор, содержащий уксусную кислоту в количестве 40 и газообразный аммиак, сохраняя концентрацию уксусной

35 кислоты в среде ниже 1,5 вес. /о и значение рН между 7,5 и 8. Таким образом, в 48 час культуре накапливается 4,34 г/дл L-лизина (эквивалентно 25,2 вес. /о относительно всего количества используемой уксусной кисло4р ты). Количество уксусной, кислоты, введенное в среду, составляет 17 /о по весу от количества исходной среды.

Из 390 мл питательного бульона получают

13,7 г неочищенного кристаллического L-ли45 зина.

Пример 2. Основную культуральную среду вводят в пять стеклянных ферменторовкачалок небольшого размера, порциями по

300 мл соответственно.

5р Все порции стерили зуют при 110 С в течение

10 мин. Обсемененный культуральный бульон в количестве 15 мл, приготовленный тем же способом, что и в примере 1, добавляют в основную культуральную среду в каждом стек55 лянном ферменторе, Инкубацию ведут при перемешивании (1350 об/мин),в условиях аэрации в том же объеме, что и для бульона.

Основная культуральная среда (рН 6,5) имеет следующий состав:

60 Ацетат аммония 1,2 о/о

Гидролизат крахмала (рас- 1 о/о считанный по глюкозе)

Сульфат аммония

КН2РО4 б5 Мд50 7Н20

440848

2 ррт

2 ррт

4 мл/дл

Fe++

Мп++

Белковый .гидролизат из соевых бобов

L-треонин 15 мг/дл

О/ -метионин 30 мг/дл

Биотин 50 у/л

Витамин Bi НС1 40 у/л

Мочевина 0,2 /о.

Когда значение рН среды становится равным приблизительно 8,2 после 5 час культивации, растворы смесей из уксусной кислоты и ацетат аммония (концентрация уксусной кислоты в растворе 60 о/о), имеющие молярные соотношения, приведенные в табл. 1, вводят в каждый фермептор до тех пор, пока значение рН среды не становится равным приблизительно 7,5. Раствор добавляют автоматически, когда значение рН среды возрастает до 7,7.

Добавление смешанного раствора прекращают для 46 час,культуры, и далее ведут дополнительную инкубацию в течение 2 час (48 час в общем).

Выход L-лизина .в каждом ферментируемом бульоне приведен в табл. 1.

Таблица 1

Образовавшийся

/-лизин в виде гидро хлорида

Моляриое отношение уксусной кислоты к ацетату аммо« ния

Рост (О.П.) выход по субстрату, о накопившийся в бульоне, г/дл

1:0,05

1;0,25

1:0,50

1:0,75

1:1

1,03

1,25

1,15

1,08

0,98

22,8

28,9

24,8

19,7

13,2

3,79

6,05

4,24

3,51

2,43

Пример 3. Основную культуральную среду подают порциями в 300 мл в ферменторы-качалки небольшого размера и стерилизуют,при 110 С в течение 10 мин.

Основная культуральная среда (рН 6,5) имеет следующий состав:

Ацетат аммония 1 2о/о

Гидролизат крахмала (рас- 1 о/о считанный по глюкозе)

Сульфат аммония

КН РО4

MgSO4 7НзО

Fe++

Мп++

Белковый гидролизат из соевых бобов

L-треонин 15 мл/дл

0,7 о/о

0,2%

0 04 о/о

2 ррт

2 ррт

4 мл/дл

О. П.— бактериальиый рост измеряли, используя электрофотокалориметр Н1тата модель 11 В по оптической плотности (log Т величины) при 562 mu, (О. П.) бульона, разбавленного в 26 раз. Субстрат — уксусная кислота и глюкоза (для табл. 1 и 2).

DL-метионин 30 мг/дл

Биотин 50 у/л

Витамин В НС1 40 у/л

Мочевина 0,2 о/о.

Обсемененный культуральный бульон

Brevibacterium flavum АТСС 21129 в количестве 15 мл, который готовят так же, как в примере 1, добавляют к основной культуральной среде в ферменторе-качалке. Инкубацию ведут при 31,5 С при скорости перемешивания

1400 об/мин с постоянной степенью аэрации.

После 5 час культивирования рН культуральной среды становится равным приблизительно 8,2. Поэтому в каждой ферментер начинают подачу раствора (концентрация уксусной кислоты в растворе 60о/о), состоящего из смеси растворов уксусной кислоты и ацетата аммония с молярным соотношением 1: 0,25 и гидролизата крахмала (рассчитанного по глюкозе) возрастающей концентрации (см. табл. 2).

Раствор подают в каждый ферментор — качалку до рН 7,5. Подачу раствора повторяют а|втоматически, если рН среды увеличивается приблизительно до 7,7.

Добавление этого раствора прекращают для

58 час культуры и затем ведут дополнительную инкубацию в течение 2 час (в сумме

60 час). Выход L-лизина в каждом ферментируемом бульоне приведен в табл. 2.

Таблица 2

Образовавшийся

L-лизин (в виде гидрохлорида) Коицеитрация уксусной кислоты, о

35 Концентрация глюкозы, о °

Рост (О. П.) накопившийся в бульоне, г/дл выход по субстрату, о

25,0

30,0

32,5

33,8

31,3

29,0

1,13

I, 16

1,22

1,27

1,31

1,36

1,5

45 6

12

7,14

8,26

8,87

9,25

8,40

7,83

2,5

50 Предмет изобретения

1. Способ получения L-лизина путем культивирования продуцирующих его микроорганизмов Brevibacterium на питательной среде, 55 содержащей в качестве источника углерода и азота ацетатные ионы и необходимые для синтеза питательные соли с последующим выделением L-лизина, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода аминокисло60 ты, из рода Brevibacterium используют штамм

flavum АТСС 21129.

2. С пособ по п. отл ич а ющи и с я тем, что концентрацию ионов ацетата в среде поддерживают равной 1,5 вес. /о, а рН среды 7,0—

65 85.