Реактив для определения фосфатаз

 

ГОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

02> 444376

Соо CooeTокнх т;оциеРиотичеок22х реооублик (61) 3ав22сю2ь222 от патента (22) Заявлено 14.11.67 (2! ) 1197398/23-4 (51) М. Кл. С 12k 1/04

G 01п 33/16

G 01п 31/14 (32) Приоритет 14.!1.66 (31) 593740

31.03.67 627430 (33) CILIA

1ооудароте.:.Кньй комнтет

СоВоТо Ьi- .-lHI- .oTI2оз CCCP па де22ем азооретеннй

OTN 2bITi221

Опубликовано 25.09.74. Бюллетень № 35 (53) УДК 577.153.082:

:543.866-41 (088.8) Дата опубликования описания 24.09.75 (72) Авторы изоо ретения

Иностранцы

Даниель Гарольд Дойч, Джон Дуглас Муррей, Стенли Эдвард Грин, Эдвард Вабе Салеби и Богдан Мирослав Стесив (США) Иностранная фирма

«Смит Клайн энд Френч Лабораториз» (США) (71) Заявитель (54) РЕАКТИВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФАТАЗ

Предлагается реактив для обнгруткепи . и количественного определения щелочнь2х и кислотных фосфатаз в биологических жидкостях, например в сыворотке.

Известен реактив для анализа фосфатаз, который включаег субстрат — двунатр2тсву2о соль и-нитрофенилфосфорной кислоты, сухой буфер для поддержания рН 4 — 11 и активатор — соль магния. Эта соль в сухом состоянии нестабильна и получение ее затруднено.

Кроме того, чувствительность известного реактива недостаточна, особенно при определении щелочных фосфатаз.

С целью повышения стабильности реактива и чувствительности анализа, предлагается реактив, в который в качестве субстрата введена аминная соль п-нитрофенилфосфорной кислоты. Келатель22о в качествс суострата использовать соль трис- (оксиметил) аминометана и и-нитрофенилфосфорной кислоты- .ил: соль дициклогексиламина и и-нитрофенилфосфорной кислоты. Целесообразно также в состав реактива добавлять маннит.

Сухой порошкообразный реактив содерокит аминную соль и-нитрофенилфосфорной кислоты, буфер (карбонат щелочного металла, например карбонат натрия и бикарбонат натрия), металлсодержащий активатор, предпочтительно глютамат магния или магниевую соль аспаргиновой кислоты, и ма222222т.

Обычно в зависимости от того, какую фосфатазу определяют, кислую пли щелочную, рН

5 поддерживают в пределах 4 — 11, соответствующим образом выбирая один пли несколько известных буфсров.

В сухом виде этот порошок стабилен и может долго сохраняться. Он может быть разде10 лен на отдельные небольшие порции для образования водного раствора, пригодного для проведения одного анализа сыворотки. Каждую из этих порций можно затем расфасовывать в виде таблеток или капсул.

15 Указанные субстраты в сухом виде более стабильны, чем двунатриевая соль и.-нитрофенплфосфорной кислоты. Маннит также увеличивает стабильность субстрата. Кроме того, он активен в энзиматической реакции. Количество

20 добавляемого маннита можно изменять в широких пределах, так как положительное влияние маннита прпблизительно пропорционально его количеству. Верх2222м пределом, по-видимому, является растворимость этого инди25 видуального вещества в воде при температуре проведения испытания, т. е. около 37 С, Точными экспериментами было установлено, что заметные результаты можно получить при концентрации дооавки несколько миллиграм30 мо в на 1 мл растворенного в воде аналитиче444376

Пример 1. Определение активности солей п-нитрофенилфосфорной кислоты (п-НФФК).

Компоненты реактива.

Буфер (рН 10,2). Растворяют 8 г Ха СОа

5 2 г NaHCO3 и 300 мг глютамата магния в

1 л воды.

Анормальная клиническая химическая контрольная сыворотка Хиланда, 0,03 М растворы ами нных солей п-НФФК.

Ip 0,03 М раств(зр двунатриевой соли п-НФФК (в качестве контрольного) .

Расчет.

Скорость реакции аминной соли п-НФФК, о/о.

ЛА4ОБ/мин (амин) ><100

15 ЬА4оь/мин (1 1аа) Свободный п-нитрофенол (вес. %) определяют при 405 ммк.

Свободный и-нитрофенол =

20 А4щ (для Пробы)

А4О, (для стандарта) В табл. 1 приведена энзиматическая активность аминных солей.

Таблица 1

Свободный п-нитрофенол, вес. о"

Соль

Скорость,, Динатрий л-НФФ

Динатрий л-НФФ

Метиламин и-НФФ

Диметил амин л-НФФ

Триметиламин п-НФФ

Моноэтаноламин и-НФФ

Морфолин п-НФФ

Монобензиламин и-НФФ

Фурфуриламин п-НФФ

Анилин п- НФФ трис-(Оксиметил) аминометан л-НФФ трис-(Оксиметил) аминометан п-НФФ (сухой)

Дициклогексиламин п-НФФ полного растворения, то твердый осадок удаляют).

В кювету отбирают пипеткой 0,05 мл образца и добавляют 2,5 мл буферного раствора (рН 10,2). Определяют светопоглощение при

30 405 ммк на любом подходящем спектрофотомегре.

Расчет.

Свободный п-нитрофенол (вес. ) =

= А4сэК0,228.

В табл. 2 приведены результаты определения свободного п-нитрофенола после обработки реагента фосфатазой, ского реактива. Пределы конструкции маннита составляют 25 — 180 мг на 1 мл разбавленного водой реактива.

Реактив можно растворять в стандартном количестве воды и смешивать затем его с биологической пробой для проведения энзиматической реакции. Количество субстрата, содержащегося в реактиве, должно быть достаточным для того, чтобы реакция происходила с постоянной скоростью. В результате определяют количество или величину активности неизвестного фермента.

Аминные соли п-нитрофенилфосфорной кислоты (n-НФФ) могут быть получены реакцией соответствующего амина с солью щелочного металла и-нитрофенилф о сфо1рной кислоты. Эти соли могут быть осаждены концентрированием или же добавлением органического растворителя. Кроме того, свободную п-нитрофенилфосфорную кислоту можно нейтрализовать соответствующим амином в растворе и осадить соль добавлением органического растворителя или упариванием до начала кристаллизации, затем соль отделяют, промывают и сушат.

* Перед добавлением сыворотки.

Определение образования п-нитрофенола из солей п-НФФК при различных внешних условиях.

Методика. Взвешивают 3 пробы каждой соли по 100 мг. Помещают первую пробу каждой соли п-НФФК в сухой эисикатор, кладут вторую пробу в эксикатор с насыщенным раствором сульфата аммония для выдерживания ее при постоянной влажности, третью пробу выдерживают при комнатных условиях.

Выдерживают все образцы в этих условиях по крайней мере в течение 48 час. Растворяют каждую пробу в 5 мл воды (свободный п-нитрофенол растворяется в 5 мл воды, если нет

104

107

I05

84

98

86

66

96

91

81

104

0,04

0,07

0,08

0,09

0,10

0,05

0,12

0,06

0,04

0,04

0,03

0,04

0,04

444376

Таблица 2

Свободный п-нитрофенол, вес.

Опыт

Соль

1 (комнатные условия) 2 (сухой) 3 (влажный) холостой

Динатрий и-НФФ

Этиламин и-НФФ

0,010

0,009

0,014

0,006

0,004

0,007

0,016

0,035

0,010

0,016

0,005

Метиламин и-НФФ

Диметиламин и-НФФ

Триметиламин и-НФФ

Моноэтаноламин и-НФФ

0,04

Не анализировали

0,007

0,04

0,04

0,02

0,03

0,03 о Растворим не полностью.

Пример 2. Методика определения щелочной фосфатазы.

Реактивы.

Раствор A. В 100 мл дистиллированной воды растворяют следующие вещества, мг:

Na CO3 850

NaHCO3 250

Магниевая соль аспарагиновой кислоты 50

Ди- (циклогексиламмонийная) соль п-НФФ 315

Б (концентрация маннита в реатенте равна

0 мг/мл).

Реагент 3: 2 мл раствора А+1 мл раствора

Б (концентрация маннита в реагенте равна

5 33 мг/мл).

Реагент 4: 0 мл раствора А+3 мл раствора

Б (концентрация манннта в реагенте равна

100 мг/мл).

Реагенты помещают в кюветы, выдержива10 ют в течение 10 мин при 37 С, после чего определяют и записывают оптическую плотность при 415 ммк.

Энзиматическую реакцию инициируют добавлением 20 Х анормальной сыворотки Хи15 ланда (серийный номер 368А16 ) ..

Показания снимают спустя 10 мин после того, как реагент смешали с сывороткой (А о) и через 15 мин (А а). Результаты приведены в табл. 3.

Раствор Б. В 10 мл свежеприготовленного раствора растворяют 1000 мг маннита.

Растворы А и Б смешивают вместе для получения четырех аналитических реагентов, как описано ниже.

Реагент 1: 3 мл дистиллированной воды.

Реагент 2: 3 мл раствора А+О мл раствора

Таб липа 3

Увеличение скорости по сравнению с опытом 2, Опыт

Ао

Вычислено

А!0

Ь, мин

0,051

0,051

0,051

279

473

0,480

0,560

0,652

0,033

0,042

0,056

0,645

0,772

0,932

27

Морфолин и-Нфф

МонЬбензиламин и-Нфф+

Фурфуриламин и-НФФ+

Анилин и-НФФ трис-(Оксиметил) аминометан и-Нфф трис-(Оксиметил) аминометан и-НФФ (сухой)

Циклогексиламин и-Нфф*

0,04

0,07

0,09

0,07

0,15

0,05

0,13

0,06

0,04

0,05

0,02

0,28

0,07

0,10

О,ll

0,14

0,04

0,11

0,05

0,04

0,04

0,02

0,04

0,07

0,09

0,20

0,11

0,05

0,15

0,05

0,04

0,04

0,02

444376

Таким образом, В оптической кювете растворяют одну таблетку (или капсулу), содержащую указанные ингредиенты, в 3,0 мл воды, добавляют 20 i. анализируемого образца сыворотки. Как только реагент и образец перемешаются, происходит следующая реакция: рН 8 — 10 (буфер)

Лминная соль+ Щелочная

-+и-НФФ фосфатаза

А1; — А!е

5 (мин) рн 8 — 10 (буфер) — — — -- - Нитрофенол+ Соль фосфорной кислоты.

Кювету выдерживают при 37 С и измеряют

15 скорость изменения оптической плотности в течение 10 мин. 1ак как это — скорость реакции, температура и определяемые интервалы должны быть точно соблюдены. общий объем 1000

17,7 .ил сыворотки

A4„ s!MK (при 5 >AH) 20

5 мин

1. Реактив для определения фосфатаз,включающий субстрат — соль и-нитрофенилфосфорной кислоты, — сухой буфер для поддержания рН 4 — 11 и активатор — соль магния, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения стабильности реактива и чувствительности анализа, в качестве субстрата использована

30 аминная соль и-нитрофенилфосфорной кислоты.

2. Реактив по п. 1, отл и ч а ю щи и с я тем, что в качестве субстрата применена соль трис(оксиметил) аминометана и п-нитрофенилфосфорной кислоты.

3. Реактив по п. 1, отл и ч а ю щи йс я тем, что в качестве субстрата использована соль дициклогексиламина и п-"гIитрофейилфосфорПОЙ K)I CJIOTbI.

40 4. Реактив по п. 1, отличающийся тем, что в его состав введен маннит. б00

250

Приоритет 14.11.бб установлен по пп. 1, 2 и 3; приоритет 31.03.б7 — по п. 4, Составитель С. Зуммеров

Тскрсд Т. Курилко

Корректор Е, Рогайлина

Редактор О. Кузнецова

Заказ 2599 1 Изд . о 575

ЦНИИПИ Государственного комитета по делам изобретений и

Москва, )К-35, Раушская

Типография, пр. Сапунова, 2

") Эту серию сыворотки предварительно калибруют хорошо известными методами для определения соответствующего числа Ме кдупародных единиц (М. Е.) следующим образом.

Оптическая плотность раствора и-нитрофепола с концентрацией 1 мкмоль/мл равна 17,7.

А418 — оптическая плотность при длине ьолны

41. ммк.

М. Е./л сыворотки = ЬА„, ммк ><

А„, ммк (при 10 мин) ммк мин:

5 мин

Общий объем = 3,0 мл.

Количество сыворотки =0,020 мл (201).

Расчет.

М.Е./л сыворотки =- ЛА„, ммк/мин ><

3,0 1000

17,7 0,020

М. Е./л сыворотки — 8450.

Для изготовления реактива сухие ингредиенты смешивают и смесь таблетируют или капсулируют известными методами. Состав таблетки реактива для 3 мл щелочной фосфатазы:

ХагСОз, мл 850

Магниевая соль аспарагиновой кислоты, мг 50 трис- (Оксиметил) аминометан п-НФФ, мг

Маннит, мг

Карбовакс 4000, мг

Предмет изобретения

Тираж 474 Поди!! с нос

Совета Министров СССР открытий наб., д. 4/5