Способ выделения антитромбина

 

О П -И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ п1) 447876

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (61) Зависимый от патента (51) М. Кл. А 611< 27/10 (22) Заявлено 08.08.72 (21) 1818160/31-16 (32) Приоритет 08.09.71 (31) 11350 (33) Швеция

Опубликовано 25.10.74. Бюллетень Мв 39

Государственный комитеТ

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 615.45;612..115 (088.8) Дата опубликования описания 26.02.75 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Ларс-Олоф Андерсон и Магги Миллер Андерсон (Швеция) Иностранная фирма

«Актиеболагет Каби» (Швеция) (71) Заявитель (54) СПОСОБ В ЫДЕЛ ЕН ИЯ АНТИ ТРОМБ И НА

Изобретение относится к области медицины и касается выделения аптптромбина из продуктоц животного происхождения.

Предложенный способ — новый, в литературе не описанный.

Цел4ю изобретения является выделение антитромбина из крови, выход которого превышает 90 о.

Эта цель достигается тем, что кровь обрабатывают сульфированным углеводом, например сшитым бромистым цианом, сульфированным полисахаридом с последующей элюцией адсорбированного антитромбина.

Способ осуществляют следующим образом.

Антитромбин получают при адекватном разделении от других протеинов исходного материала. Чтобы получить большее количество антитромбина, его адсорбируют из фракции

Конха при добавлении геля к раствору этой фракции.

После адсорбции гель отфильтровывают, промывают и элюируют. После фильтрования

lR) геля от элюата íà Scphadex — С150 получают чистый антитромбин.

Примерами гелей, пригодных для использования в качестве адсорбентов, являются следующие: сшитый сульфат декстрана; сшитый сульфат декстрана-агароза; сшитый гепарин; сшитая гепарин-агароза; сшитый сульфат хондраутпна-агарозы.

Сшитые индивидуальные гели готовят при добавлении бромистого циана к раствору полисахарида, причем при установлении рН около 11 происходит сшивка между молекулами и образование геля. Смешанные гели получают при добавлении сульфированного полиса10 харида к гелю агарозы (Sephadex 4В,, (R)

Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) с последующим добавлением бромистого циапа при рН 11. Эти типы гелей облегчают регу15 лировапие и получение более высоких скоростей, чем индивидуальные гели.

Пример 1. К раствору 100 мл сульфированного декстрана (20 мг/мл) прибавляют 5 г

BrCN, Затем повышают рН до 11 в течение

20 7 мин с помощью 5М NaOH и оставляют смесь на ночь при перемешивании. Образуется паста белого гранулированного геля. Пасту набивают в небольшую колонку 5 мм,к 8 см и уравновешивают буфером 0,02М TRIS, 0,01М соли

25 лимонной кислоты и 0,15М NaC1 (рН 8,5).

Через колонку пропускают 2 мл нормальной плазмы, После прохода через колонку плазма теряет свою свертываемость. Колонку сначала

447876

Предмет изобретения

Составитель С. Малютина

Техред В. Рыбакова Корректор И. Позняковская

Редактор Д. Пинчук

Заказ 431)5 Изд. Ко 296 Тираж 482 Подписное

ЦНИИПИ Государственного когяитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, jK-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 промывают исходным буфером, а затем элюируют частями, увеличивая концентрацию соли до I М NaCI. Элюат содержит материал, который после диализа на фосфатном буфере удлиняет время коагуляции нормальной плазмы после повторной рекальцификации от 3 до

45 мин. Иммунологический анализ показывает наличие в элюате антитромбина и некоторых липопротеинов.

Пример 2. Адсорбция из плазмы с помощью геля сшитой сульфированной декстранагарозы. Градиентное элюирование.

Сульфированный декстран готовят при смешивании раствора 30 мл сульфированного декстрина 15мг/мл, 50мл 4 /о-ных гранул полимиризованной агарозы и I г BrCN (рН 11).

Смесь выдерживают при перемешивании в течение 7 мин и поддерживают рН непрерывным добавлением NaOH. После этого добавление щелочи прекращают, и через 5 мин рН падает до 8,5. Перемешивают в течение ночи при комнатной температуре, затем гель промывают.

Заполняют колонку полученной таким образом сульфированным декстраном-агарозой. На стадии адсорбции через колонку пропускают

3 мл нормальной плазмы, смешанной в соотношении 1: 1 с буфером (0,02М трис-буфер, 0,01М соли лимонной кислоты, 0,015M NaCI, рН 8,5). После прохода через колонку элюат концентрируют до 3 мл объема и испытывают

4 на способность к коагуляции. Во время прохода через колонку плазма теряет свою способность к коагуляции. Адсорбированный материал десорбируют 0,02 М трис-буфером и

5 0,01 М соли лимонной кислоты (рН 7,3) при изменении концентрации NaCI от 0,15М.

Элюат состоит из двух компонентов, одним из них является липопротеиновая фракция типа пре-бета и антитромбин Ш. Идентификацию

10 проводят иммунологическими и физико-химическими методами.

Пример 3. Адсорбция из плазмы гелем сшитой гепарин-агарозы.

Гепарин-агарозу готовят, как описано в

I5 примере 2, для сульфированного декстранаагарозы. Вместо сульфата декстрана используют 30 мл раствора гепарина (500 мл — ).

Гель помещают в колонку и проводят эксперимент, как описано в примере 2. Получают

20 те же результаты.

Способ выделения антитромбина, о т л и ч а25 ю шийся тем, что материал животного происхождения, например кровь, обрабатывают сульфированным углеводом, например сшитым бромистым цианом, сульфированным полисахаридом с последующей элюцией адсор30 бированного целевого продукта.