Способ получения дез-аланин-в-30инсулинов
— — -Ф1
;:о: :
О П .И © :А-:-Н -И Е
ИЗОБРЕТЕН ИЯ » 469686
Сеоз Советских
Социалистических
Республик (61) Зависимое от авт. свидетельства (22) Заявлено 15.05.73 (21) 1921891/23-4 (51) М. Кл. С 07с 103,/52 с присоединением заявки № (32) Приоритет
Государственный комитет
Совета Министров СССР
Опубликовано 05.05.75. Бюллетень № 17
Дата опубликования описания 08.08.75 (53) ДК 577Л7.07, (088.8) по делам изобретена и открытий (72) Авторы изобретения
О. С. Каринская, В. Ф. Кривцов и Ю. П. Швачкин (71) Заявитель
Институт экспериментальной эндокринологии и химии гормонов АМН СССР (54) спосоБ получения дез-АЛАнин-В"-инсулинов
Изобретение относится к способу получения дез-алании-В о-инсулинов, обладающих полной биологической активностью соответствующих природных инсулинов, но отличающихся от них своими иммунохимическими свойствами.
Известен способ получения дез-алании-B инсулинов путем катализируемого карбоксипептидазой А гидролитического отщепления аланина-Вво от природных инсулинов.
Однако наряду с целевыми продуктами образуется дез-алании-Вао-дез-аспарагин-Ае -инсулин, который трудно отделяется и загрязняет целевые продукты.
С целью повышения степени чистоты целевого продукта предлагается гидролиз природного инсулина, катализируемый карбоксипептидазой А, проводить в водном растворе, содержащем 40 — 60 об. 7О органического растворителя, например этанола, при нагревании, преимущественно при 30 — 50 С, с последующим выделением целевых продуктов известным способом.
П р и м ер. 1,2 г кристаллического свиного инсулина при 40 С растворяют в 55 мл 0,1 н. трис-буфера (рН 8,5), приливают 45 мл этанола, нагревают до 40 С, добавляют 1,2 мл суспензии карбоксипептидазы А, содержащей
0,1 г фермента (фирма «Реанал», BHP) в
4,4 мл, инкубируют 4 час при 40 С, добавляют еще 1 мл суспензии карбоксипептидазы А и кубируют 3 час при 40 С. К смеси прибавляют
5,7 н. соляную кислоту до рН 3, упаривают до объема 25 — 30 мл, оставляют на 2 — 3 час
5 при 0 — 4 С и отделяют неактивную карбоксипептидазу А центрифугированием. К фильтрату добавляют сухой трис-(оксиметил)-аминометан до рН 8,0, наносят раствор на колонку (40+3,5 см) с Сефадексом 6-25. предвари10 тельно уравновешенную 0,05 М раствором бикарбоната аммония, и алюируют этим же буферным раствором, собирая фракции по 5 мл.
Содержание белка во фракциях определяют спектрофотометрически при 278 нм. Фракции, 15 содержащие белок, объединяют и лиофильно высушивают. Выход целевого продукта 1,15г, При электрофорезе (750 в, 2 час) на бумаге в 0,1 М растворе лимонной кислоты, содержащем 4 моль мочевины, полученньш дез-аланин20 В -инсулин движется однородным пятном, подвижность которого аналогична подвижности исходного свиного инсулина. Дез-аланинВз -инсулин выделен в аналитически чистом виде с выходом, близким к количественному.
Аминокислотный состав полученного дезаланин-В"-инсулина и исходного свиного инсулина определяют на аминокислотном анализаторе типа «Унихром» фирмы «Бекман»
ЗО (ФРГ) .
469686
Составитель Л. Фонина
Техред Г. Дворина
Корректор Л. Котова
Редактор T. Шарганова
Заказ 192219 Изд. М 669 Тираж 529 Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий
Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Типография, пр. Сапунова, 2
Полученный дез-алании-Вао-инсулин и исходный свиной инсулин содержат в остатках (теоретически) 1,00 (1) и 1,00 (1) лизина;
1,94 (2) и 1,93 (2) гистидина; 1,00 (1) и
1,00 (1) аргинина; 3,00 (3) и 2,93 (3) аспарагиновой кислоты; 1,68 (2) и 1,71 (2) треспина; 2,58 (3) и 2,83 (3) серина; 7,39 (7) и 7,27 (7) глютаминовой кислоты; 0,98 (1) и 1,07 (1) пролина; 4,00 (4) и 4,00 (4) глицина; 1,07 (1) и 2,03 (2) аланина; 5,22 (6) и 5,21 (6) /зцистина; 3,91 (4) и 3,89 (4) валина; 1,75 (2) и
1,71 (2) изолейцина; 6,09 (6) и 6,15 (6) лейIIHHa; 3,80 (4) и 3,79 (4) тирозина и 2,88 (3) и 2,89 (3) фенилаланина соответственно.
При определении содержания аминокислот в остатках для каждого инсулина за единицу принята /4 содержания глицина. Гидролиз дез-алании-Взо-инсулина (4 мг), катализируемый карбоксипептидазой А и проводимый в
0,1 н. трис-буфере (рН 8,5) в течение 2 час при 37 С, приводит к отщеплению только аспарагина (0,35 мкм), как С-концевой аминокислоты.
В аналогичных условиях гидролиз свиного инсулина сопровождается отщеплением аспарагина (0,31 мкм) и аланина (0,47 мкм)..
Таким образом, под действием карбоксипептидазы А в предлагаемых условиях от свиного
5 инсулина отщепляется единственный аминокислотный остаток — остаток аланина, занимающий положение 30 в цепи В.
Предмет изобретения
1. Способ получения дез-алании-Взо-инсулинов путем гидролитического отщепления аланина-Взо от природных инсулинов, катализируемого карбоксипептидазой А, о т л и ч а ю15 щи и с я тем, что, с целью повышения степени чистоты целевого продукта, гидролиз природного инсулина, катализируемый карбоксипептидазой А, проводят при нагревании в водном растворе, содержащем 40 — 60 об. органи20 ческого растворителя, например этанола, с последующим выделением целевого продукта известным способом.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс ведут при 30 — 50 С.
