Способ выделения рибонуклеиновой кислоты из митохондрий

 

О П И С Ж"Н" и е

ИЗО6РЕТЕНИЯ

< >53595О

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт, свид-ву— (22) Заявлено 29.08.75 (2! ) 2168799/13 с присоединением заявки ¹â€” (23) Приоритет— (43) Опубликовано 25.11.76. Бюллетень № 43 (45) Дата опубликования описания 28.01.77 (51)М K.ч 2А61 К37/ 10

Сосударственныи комитет

Совета Министров СССР ло делам изобретений и открытии (53) УДК 547.963.32 (088.8) :а:.

H. В. Адрианов, Ю. А. Бледнов и H. Г. Шуппе (72) Авторы изобретения

Второй Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н. И. Пирогова (71) Зая,витель (54) СПОСОБ ВЫДЕЛ ЕН ИЯ

РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

ИЗ МИТОХОНДРИИ

Изобретение относится к области биохимии и может найти применение для аналитического изучения и для препаратизного получения рибонуклеиновой кислоты (РНК).

Известен способ выделения РНК пз митохондрий, заключающийся в гомогенизацпи тканей, центрифугирозании, осаждении митохондрий пз надосадочной жидкости, повторном центрифугировании для очистки от примесей и ресуспендировании в депротепнизирующих смесях (1).

Целью изобретения является выделение недеградирозанной РНК.

Это достигается тем, что гомогенизацию тканей проводят в буферном растворе, содержащем 1 — F10 млголей хлористого магния и ингибиторы рибонуклеаз, например смесь 0,01—

0,1%,"ïîëèBHíèëñóëüôàòà и 0,01 — 0,1% макалоида, очистку проводят в тех же растворах, дополнительную очистку проводят путем цецтрифугирования через 5 — 10%-ный раствор фиколла или обработки 0,1 — 0,2%-ным дигптонином, выделение РНК проводят при 0—

2 С и для депротеинпзации используют смесь фенол-хлороформ (1: 1 по объему).

Пример 1. Печень крыс извлекают и гомогенизируют в 0,01 лоля трис-НС1 буфере, рН 7,4, содержащем 0,25 ло гя сахарозы, 1 лтмоль хлористого магния и смесь 0,5 /о поливинилсульфата и 0,5% макалоидасинтетических ингибиторов рибонуклеаз. Гохгогенат дважды центрифугируют при 500 g з течение 10,иия для удаления примесей целых клеток и ядер, Из полученной надосадочной жидкости митохондрии осаждают центрифугированием при

7500 g зтечение 10,лгия. Осадок митохондрий ресуспендируют в среде выделения и повторно переосаждают центрифугпрованием з тех же условиях. Эту процедуру очистки повторяют еще дважды. Выделенные,митохондрии подвергают дополнительной очистке. Для этого их суспендпруют в среде выделения и наслаивают ila 7%-ный раствор фиколла, приготозленного на среде выделения, а затем центрифугируют прп 15000 g в течение 10 лгин.

Все операции по выделению и очистке митохондрий проводят при 0 — 2 С. Из конечны.;. суспензий митохондрий отбирают аликзоты для определения количества белка и РН1<, определения дыхательной активности митохондрий и активности маркерных ферментов микросом и лизосом.

Для выделения РНК митохондрии суспендируют в 0,01 моля калийацетатном буфере, рН 5,1, содержащем 1% додецилсульфата натрия и смесь 0,5% поливи нилсульфа та и 0,5% макалоида. К полученной вязкой суспе|нзии добавляют равный объем смеси фенол-хлороформ (1: 1 по ооъему) 535959

Формула изобретения

Составитель С.

Малютина

Техред А. Камышннкова

Корректор И. Снмкина

Редактор А. Бер

Заказ 1149/1738 Изд. ¹ 329 Тираж 630 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Я-35, Рвушская наб., p,. 4/5

Тнп. Харьк, фил. пред. «Патент» и встряхивают на качалке при 2 С в те:;е:-гие

10 мин. Фазы разделяют центрифугнро- а:шем при 5000 об/мин в теченпе 20 л ин. Ни;1:0"и органический слой удаляют шприцем, а промежуточный и водный слои повторно экстрагируют смесью феноч-хлороформ, После улаления органического слоя промежугочнын и водный слои экстра гируют последовательно

4 раза хлороформом, встряхивая с лесь прп

2 С в течение 5 мин. Фазы разделяют цеи- 10 три фуг11рованием цри 5000 об/мин в течение

15 мин. В процессе очистки промежуточный слой полностью исчезает. PHD из водного слоя осаждают 2 оо. холодного этанола, содержащего 0,1 моля хлористый натрий. Ос="док РНК растворяют в 0,01 моля калий-ацетатном буфере, рН 5,1, определяют количество и фракционируют в 5 — 20%-ном лугпейном градиенте сахарозы, притотовленно. ., на

0,01 моля калий-ацетатном буфере, рН 5,1, содержащем по 1,00 мкг/л полнвпнилсульфата и макалоида, .0,1 моля хлористого натрия

0,05% додецилсульфата натрия. ,При выделении РНК этим способом и; наблюдается признакоз деградации митохондр 1àëüíîé PHK.

П р и:м е р 2. Печень крысы извлек ют и гомогенизируют в 0,05 моля трио-НС! буфере, рН 7,4, содержащем 0 2о моля сахарозы, 10 л1моль хлористого магния и природный 30 ингибитор рибонуклеаз. Природный ингибитор рибонуклеаз выделяют из печени крысы.

Для этого 1печень гомогенизируют в 10 ммолях трис-НС1 буфере, рН 7,4, содержащем

0,3 моля сахарозы, 2,5 ммоля хлористого ка- 35 лия и 25 ммоля хлористого магния. На 1 г веса печени берут 4 мл среды выделения. Полученный гомогенат центрифугируют при

12000 0 в течение 10 мин. Надосадочную жидкость центрифугируют при Зб0000 g 2 час. 40

Полученный супернатант является ингибитором рибонуклеаз. При выделении митохондрий его добавляют в среду выделения в соотношении 1: 1.

При выделении митохондрий го; 1оге11 ат центрифугируют при 1000 g в течение 10 мин для удаления примесей целых клеток и ядер.

Из полученной надосадочной жидкости митохондрии осаждают при 1000 g в тече:.и:

10 мин. Трижды проводят дополнительное переосаждение митохондрий в тех же условия.:.

Выделе;-шые митохондрии подвергают дополнзпгельной очистке путем обработки днгито.-пином, Для этого к митохондрням, суспендирова.пым в минималь11ом объеме (около 100 мг митохондрпального белка/лл), добавляют растзор дигитонина до конечной концентрации 1,5 л1г/100 мг белка митохондрий. Раствор дигитонина готовят непоаредственно перед î IbIToì на среде выделения в концентрации 15 мг/мл. Митохондрии выдерживают с дигитонином 15 лвин при 0 С и, разбавив средой выделения, осаждают при 8000 g в течение 10 мин. Операции по выделению митохондриальной PHD те же, что в примере 1.

Способ выделения рибонуклеиновой,кислоты из митохондрий, заключающийся в гомогенизации тканей, центрифугировании, осаждении митохондрий из надосадочной жидкости, повторном центрифугировании для очистки от примесей и ресуспендированпн в депротеинизируюгцпх смесях, отличающийся тем, что, с целью выделения недеградпрованной рибонуклеиновой кислоты, гомогенизацию тканей проводят в буферном растворе, содержащем 1 — 10 ммолей хлористого магния и ингибиторы рибонуклеаз, например, смесь 0,01—

0,1% поливинилсульфата и 0.01 — 0,1 /p макалоида, проводят очистку в тех же растворах, дополнительную очистку и выделение рибонуклеиновой кислоты прп 0 — 2 С и для депротеинизацин используют смесь фенол-хлороформ (1: 1 по объему).

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительную очистку проводят путем центрифугирования через 5 — 10% -нь1й раствор фи колла.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительную очистку проводят путем обработки 0,1 — 0,2%-HbIM дигитонином.

Источник информации,,принятый во внимание при экспертизе:

1. «Молекулярная биология», 1969, № 3, с. 315 — 321 (прототип).