Способ получения токсина

 

Свез Советское

Социалистических

Расну6лин

{6ЦДополннтельное к авт. Санд-ву— (22} Заявлено 20.04.76 (21) 2349496/13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 05.09.77.Бюллетень №33 (45} Дата опубликования описания 14.10.77 (Я) P,. (л2

С 12 9 7/00

Гасударственная ноннтат

Мета Мннннтрнв КР в,аемн нзобретвннй н еткрмт и (53) УДК Ь 576.8,097.29 (088. 8) (72) Автори изобретения

И. А. Баснакьян, В. А. Мельникова, H. В. Волкова, В. М. Мерцалов Т. A. Ар|емьева и В. С. Грунуовнч (71) Заявитель

Московский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова (54) СПО СОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОКСИНА

Изобретение относится к микробиологии, а именно к культивированию патогенных микроорганизмов, которые найдут применение при производстве анатоксинных препаратов, используемых в медицине. б

Известен способ получения токсина путем предварительного выращивания инокулюма токсинообразуюших микроорганизмов с последующим культивированием при непрерывной подаче питательной среды (1) ..

1

Недостатком известного способа является то, что в течение переходного (от перис дического к непрерывному) режима наблюдается вымывание активной части токсина, что снижает его выход. l5

Целью изобретения является повышение выхода токсина.

С этой цепью питательную среду начинают подавать при соотнэ1чении удельной скорости образования токсина и удельной яо скорости роста микроорганизмов 2:1.

Способ осушествляют следуюшим образом.

Сначала подготавливают посевнэйматериал, Исходным посевным материалом в работе й5 служит культура C(osridium рефЫдем тина А (штамм № 28 ВР6К}, хранившаяся в пробьфках на среде Китт-Тороцци с мясным фаршем под споем вазелинэвогэ масла иа холоду.

Эту культуру засевают в количестве 1%,в

200 мл регенериро ванной казеинэвэ-панкреатн» ческой среды с пшеном и ватoR во флаконы, в которые добавляют 1% глюкозы и помешают на 6-18 час в термостат при

37 С.

После этогэ из флакона стерильно берут пробу культуры и разводят ее в стерильном физиологическом растворе 1:100 для подсчета выросших бактерий. Наилучшим посевным материалом считают тэт, в котором клетки имеют вид коротких палочек одинаковой формы, а концентрация бактерий составляет 2,0-2,5 ° 100 клеток (в мп}.

Полученную бактериальную культуру используют в качестве посевного материала (инокулю ла) для пэследуюшего процесса предварительного периодического вырашивания. С этой целью подготавливают к работе установку, подогревают в ферментере питательную среду до 37 С н вносят

571511 посевной материап в количестве 2% (30 м, на 1,5 и казеиново-панкреатической питатецьной среды без пшена и веты.).

Пврвд работой в бутыпи с питатепьной средой стерильно добавпяют 1% гпюкозы.

Бутыпь помещают на установку и стерипьйо соединяют с сифоном дпя подачи питатеттьной среды в ферментер.

Вкпючают систему записи оптической плотности, учета гаэообраэования и регист ð ракии рН. Начапо роста купьтуры опредепяют по снижению величины рН, начапу гаэообразования, возрастанию степени мут ности купьтуры и увепичению концентрации бактерий. 15

Концентрацию бактерий и активность токсина опредепяют в пробах, взятых в процессе предваритепьного купьтивирования с интервалами 0,5-1 час. Поспедттюю пробу берут в момент снижений гвзообразования ð и прекращения роста купьтуры.

Концентрацию бактерий опредепяют в камере Горяева. В ряд пробирок разпивапи по 4,5 мп физиоцогического раствора. В каждую пробирку вносят 0,5 мц предваритецьно перемешанной купьтуры на определенном этапе развития. На рабочий участок камеры ппотно притирают покровное стекпо.

Купьтуру в разведении 1:100 вносят под покровное стекпо так, чтобы под ним не . ЗО оказапось воздушных пузырьков. Подсчет ведут с помощью. микроскопа при увеличении в 280 раз в 1бб мапых квадратах камеры. Копичество кпеток, попученных поспе подсчета, пересчитывают на 1 мп 35 куньтуры. Расчет проводят по формупе:

M r n Ю где тт -чиспо бактерий на 1 мн купьтурьтт х - чиспо бактерий в 100 мапьгх квад- 40 ратах;

П -поправка на разведение, Qns опредепения активности токсинов получают стерипьные пвнтрифугаты купт тур Cfostridbpm )Вф ттт СО из которых де- 45 пают ряд разведений 0,9%-нымраствором. хпористого натрия. Разведенный токсин вводят в вену хвоста бепЪ|м мышам весом

l6-18 г по О,S мп. За одну минимальную дозу (1 дм /нл )принимают наименьшее 50 копичество токсина, способного при внутривенном введении вызывать гибель не менее . 50% взятых дпя опытов бепых мышей в течение 4 суток. За титр токсина принимают .наибопьшее его разведение, при котором 55 происходит гибель бопее 50% мышей на

4 сутки в пересчете на 1 мп при введении

0,5 мл токсина.

Поспе завершения контропьного периодического куньтнвирования инокупюма н 60 выбора периода с оптимальным соотношением удепьных скоростей вкпючается одна иэ систем дозированной непрерыв >й подачи питатепьной среды и начинается непрерывное выращивание купьтуры. При этом подачу питатепьной среды производят таким образом, чтобы скорость разбавления быпа равна по абсопютной вепичине удельной скорос ти роста s избранный период развития па пупяции. Еспи соотношение удепьных скороотей процесса является оптимальным, то в переходном (от периодического к непрерывному) режиме концентрация токсина не будет снижаться, а останется на постоянном уровне, т. е. повысится выход токсина при непрерывном купьтивнровании микро» организмов.

Еспи в процессе периодического купьтивирования нет периода, в котором удепьная скоростЬ синтеза токсина в 2-3 раза превышает удепьную скорость роста, спедует подобрать усповия купьтивирования (питатепьная среда, ферментер, аэрация т перемешивание и т. д.т таким образом, чтобы попучить жепаемое соотношение.

Резупьтаты непрерывного купьтивирования ИОа тМ4ю < " т т " д гттпа А штамма

ВР6К в лабораторных условиях покаятвают, что поспе начапа подачи среды в ферментер, в котором выращивается инокупюм, концентрация токсина (дм / мп) не снижается и остается при этом высоком уровне в течение поспедующего режима непрерывного купьтивирования.

Предцагаемый способ предотвращает вымывание токсина в переходном режиме, обеспечивая высокий выход токсина при непрерывном купьтивировании микроорга-

: ниэмов.

Формупа изобретения

Способ попучения токсина путем предваритепьного выращивания инокупюма токси» нообразующих микроорганизмов с поспедующим культивированием при непрерывной подаче, питательной среды, о т и ич а ю m и и с я тем, что, с цепью пп вышения выхода токсина, питатепьную среду начинают подавать при соотношении удепьной скорости образования токсина и удепьной скорости роста микроорганизмов

2:1.

Источники нттфврмацин, ттринятые во внимание ттрн: ар:ттертгнзэ.

1. Мерцапов В. М. Непрерывное купьтивирование патогенных анаэробов на мо-. депи Стоатлчтбопт регут т епь типаА, (шгамм

BP6k), «анд, дисс, М., 1968 г.