Способ получения ацилазы 1

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (1ц 572495

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 19.12.75 (21) 2301726/13 (51) М. Кл.-" С 12Р 13/10 с присосдипсписм заявки,№ г

Государственный комитет

Совета Министрав СССР не делам изобретений и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 15.09.77. Бюллетень ¹ 34 (53) УДК 577.15.663.1 (088.8) Дата опубликования описания 20.10.77 (72) Авторы изоб|ретения

А, Ф. Лидере, 3. А. Виестуре, А. М. Зилбере и В. Я. Пундуре (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЦИЛАЗЫ 1

Изобретение относится к области технической микробиологии, а именно к способам получения фермента ацилазы 1, применяемой в прикладной органической химии и медицине для получения оптически активных аминокислот и D-ациламинокислот, которые широко используются в народном хозяйстве.

Известен способ получения ацилазы 1 путем культивирования микроогранизмов рода

Azotobacter chroococcum на питательной среде, содержащей источник углерода и сернокислый магний, при рН 7,2 — 7,5, отделения биомассы и выделения ацилазы 1 (1). Продуктивность применяемого штамма низка, используется сравнительно дорогая среда.

Целью изобретения является повышение выхода целевого фермента и ускорение процесса.

Для достижения поставленной цели из микроорганизмов рода Azotobacter chroococcum используют штамм 636, при этом в питательную среду вводят калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, кальций хлористый, железо хлористое, марганец хлористый, натрий молибденовокислый и борную кислоту, Штамм Azotobacter chroococcum 636 имеет следующие характеристики, Штамм Azotobacter chroococcum 636 получен из коллекции музейных культур кафсдры микробиологии МГУ в 1969 г.

Azotobacter chroococcum 636 представляет собой микроорганизм, способный развиваться на безазотистых питательных средах и прп интенсивной аэрации фиксировать азот атмосферы. Культура также способна использовать связанные формы азота в низких кон-!

О центрациях. Добавки минерального плп органического азота в питательную среду действуют как антагонисты к связыванию атмосферного азота.

Морфологические свойства. Имеет клетки

15 различной величины, от палочковидных до кокковидных. Молодая клетка представляет собой толстую, подвижную палочку размером

2,0;к,1,2 мкм. Взрослая клетка становится круглой или овальной и уменьшается в раз20 мерах (1,5к 1,2 мкм). Эти мелкие клетки, выделяя плотную капсулу (вещество, которое окутывает клетку и находится в непосредственном контакте с ней), превращаются в цисты, представляющие собой покоящиеся

25 формы. Штамм отрицательный по Грамму, клетки образуют пигмент от бело-желтого до буровато-черного цвета.

Физио.гогические свойства. Аэроб, нс растет или проявляет слабый рост на белковых среЗ0 дах при низких пределах рН, Окпсляет без572495

55

65 азотистые органические вещества до СО, и

Н О. Углеродное питание штамма характеризуется сбра>киванием моно-, ди-, лолисахаридов, спиртов и органических кислот. Из последних слабо используют бензойпую, гиппуровую кислоту, а также некоторые аминокислоты — глицин, триптофан, лейцин, валин, тирозин, Зона роста культуры лежит в пределах рН

6,0 — 9,5, оптимум роста при рН 7 — 8, температуре 26 — 28 С. Культура имеет дезаминирующие способности; для лабораторных животных не патогенна.

Изобретение обеспечивает повышение выхода блок!ассы (25 выше известного) за счет более высокой продуктивности штамма, обеспс«ива!ощего направленный биосинтез ацплазы. Упрощение процесса достш ается тем, «То сокращ!!ется длительность процесса — штамм 636 развивается па простой питательной среде, обеспечивающей ускорение обмела всществ в клетке и сокращсл цикла развит1!1! клсткll. Ко!!еll, лог!lрпфми !сской фазы развития клетки как период оптимального накопления фермента ацилазы 1 приходится на 30-й час культивирования. В силу изменения азотного литания клетки получаемый фермент обладает широким спектром специфичности по отношению к ациламинокислотам: N-ацетил-dl-метионину, N-ацетилdl-аланину, N-ацетил-dl-серину, N-ацетил-dlфенилглицину, N-хлорацетил-dl-фенилглицин т

Биосинтез фермента ацилазы 1 штаммом

636 совершается путем биологической фиксации азота атмосферы, т. е. метаболизм штамма 636 отличается от известного, развитие которого происходит на аминном и неорганическом азоте. Фосфорное питание обеспечивается фосфатами. Фосфаты совместно с ионами Са буфирируют среду, поддерживая желаемый рН. В условиях интенсивной аэрации углевод (глюкоза или сахароза) обеспечивает углеродное питание клетки и является источником энергии.

Предлагаемый способ заключается в следующем.

Для получения фермента ацилазы 1 выращивают Azotobacter chroococcum 636 на минеральной среде с 1,5 — 2 /О углевода. Среда обеспечивает потребность микроорганизма в фосфоре, углероде, микроэлементах и энергии. Особенности штамма и интенсивная аэрация определяют азотное питание при помощи биологической фикции азота. Ферментация культуры производится при 27 С в аэробных условиях (2 л воздуха на 1 среды) в течение 30 час.

Выход биомассы 25,0 г/л.

Активность ацилазы, ед. на 1 мл культуральной жидкости, к субстратам:

N-ацетил-dl-метионин 26,7

N-ацетил-dl-алании 30,1

N-ацетил-Ж-серии 25,8

)5

N-ацетил-dl-фенилглицин 13,5

N-хлор ацетил-dl-фенилглицин 16,1

После ферментации биомассу отделяют центрифугированием, промывают физиологическим раствором и подвергают замораживанию, лиофилизации или обработке ацетоном.

Активность такой ацилазы сохраняется до

6 месяцев без потерь и ее можно применять для ферментативного гидролиза ациламинокислот.

При м е р 1. В качестве продуцента ацилазы 1 используют культуру Azotobacter chroococcum 636. Биосинтез фермента штаммом производится на следу!ошей питательной среде (г/л):

Калий фосфорноклслый однозамещенный 1,5

Калий фосфорнокислый двузамсщен ный 05

Магний сернокислый 0,1

Натрий хлористый 1,8

Кальций хлорпстый 2,0

)Кслезо хлористое 0,01

Марганец хлористый 0,01

Натрий молибдсновокислый 0,01

Борпая кислота 0,002

Углевод (глюкоза, сахароза) 15,0

Глюкозу (1,8 /Π— 360 г/л) готовят отдельно, стерилизуют при 0,5 атм 30 мин и стерильно добавляют к ферментационному раствору.

Культуру Azotobacter chroococcum 636 поддерживают íà 2 /О -ной агаризованной синтетической среде. Используют культуру после

48 час выращивания на косом агаре, потом пересеивают в колбу с 100 мл жидкой питательной среды, ставят на качалку при 27 С ла 24 час (логарифмическая фаза развития клетки). Приготовленный посевной материал используют для инокуляции ферментаций— с расчетом 10 мл клеточной суспензии на 1 л питательной среды. Ферментацию культуры производят при 27 С с аэрацией (2 л воздуха па 1 л питательной среды) в течение

30 час.

Во время ферментации контролируют прирост биомассы, рН, температуру среды, степень аэрации и активность ацилазы в культуральной жидкости.

Активность ацилазы, ед. на 1 мл культуральной жидкости, к ациламинокислотам:

N-ацетил-dl-метионин 24,6

N-ацетил-dl-алании 31,2

N-ацетил-dl-серии 33,0

N-ацетил-dl-фенилглицин 1 1,2

N-хлорацетил-dl-фенилглицин 13,4

Выход биомассы 26,5 г/л.

Формула изобретения

Способ получения ацилазы 1 путем культивирования микроорганизмов рода Azotobacter

chroococcum на питательной среде, содержащей источник углерода и сернокислый магний, при рН 7,2 — 7,5, отделения биомассы и выделения ацилазы I, отл ич а ющийся тем, что, с целью повышения выхода целево872495

Составитель Т. Серебренникова

Редактор Е. Хорина

Тсхред М. Семенов

Корректор Л. Денискина

Заказ 2221/14 Изд. № 763 Тираж 564

1-1ПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписка

Типография, пр. Сапунова, 2

ro фермента и ускорения процесса, из микроорганизмов рода Azotobacter chroococcum используют штамм 636, при этом в питательную среду вводят калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, кальций хлористый, железо хлористое, марганец хлористый, натрий молибденовокислый и барную кислоту.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Японии Мю 8635, кл. 36/2 35 серия 1. Сборник 426, 1970.