Способ определения эффективного тироксинового отношения в пробе крови

 

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 576976 (61} Дополнительный к патенту (51) М. Кл. G 01N 33/16 (22) Заявлено 29.03.73 (21) 1811896/1902369/13 с (23) Приоритет 12.07.72 (32} 12.07.71

Гасударственный иомитет

Совете Министров СССР по делам изобретений и открытий (31) 161882

{33) США (43) Опубликовано 15.10,77, Бюллетень М 38 (45) Дата опубликования описания 25.10.77 (53) У ДК 615.361.441".

:615.15 (088.8) (?2) Автор изобретения

Иностранец

Эверет Е. Минсей (США) Иностранная фирма

"Бик — Маллинкродт Хемише Продукте ГмбХ" (ФРГ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОГО

ТИРОКСИНОВОГО ОТНОШЕНИЯ В ПРОБЕ КРОВИ

Изобретение относится к области медицины и может найти применение для точного определения функции щитовидной железы.

Предлагаемый способ является новым и в патентной и технической литературе не описан.

Для определения эффективного тироксинового отношения в пробе крови по предлагаемому способу смешивают раствор меченого гормона щитовидной железы с двумя порциями сыворотки крови, первая из которых по существу свободна от глобулина, связывающего тироксин, а вторая содержит ненасьпценный глобулин, связывающий тироксин, выдерживают в контакте с ионообменной смолой, после чего определяют отношение количества меченого гормона щитовидной железы, связанного с глобулином, к количеству меченого гормона щитовидной железы, не связанного с глобулином.

Кроме того, меченый гормон щитовидной железы содержит радиоактивный йод, а отношение объема первой порции сыворотки крови (без глобулина) к второй порции сыворотки крови (с глобулином) составляет 10: 1 — 30: 1.

Способ осуществляют следующим образом. Меченый реагент тироксина и глобулина, связанного с тироксином (Tq, TBG) представляет собой буферное разбавление ооъединенной нормальной сыворотки, содержащей барбитал и тироксин меченый

J-125 и готовят его следующим образом.

К 78 мл сыворотки добавляют 1850 мл барбитального буферного раствора с рН 8,6, содержащего

2,39% барбитала натрия и 0,76% азида натрия (микробиологическое консервирование), рН доводят с помощью HCI. Добавляют также небольшое количество радиоактивного тироксина (T4) (около

1р 0,13 мкл) в качестве трассера для определения эффективности экстракции.

Готовят экстракционную колонку путем заполнения стеклянной колонки достаточным количеством ионообменной смолы с получением объема

1б слоя около 1000 мл при расходе жидкости около

10 мл/мин. Для этой цели применяют сильноосновную смолу типа четвертичного аммония. Например, можно применять промышленную смолу этого типа

"Амберлит 3РА-400", но можно также применять и другие аннонно- или катионно - избирательные смолы.

Смолу загружают в колонку в виде водного шламма, над смолой всегда поддерживают слой водьь Колонку соединяют с сосудом. содержащим раствор сыворотки, подлежащей экстрагированию, и начинают пропускать сыворотку;врез колонку, Периодически отбирают пробу элюата (1 мл) и подсчитывают его радиоактивность для определения эффективности экстракции. Радиоактивность должна cocT32JIHTb 10% B меньше оТ радиоакBIBности исходного раствора.

Приблизительно к 8 мл барбитального бу.рерного раствора добавляют достато яое количество (0,125 г ЕДТА = Ма ) двунатриевой соли ЕДТА для создания концентрацж 0,1 мг/мл двунатриевой соли ЕДТА в элюате колонки (экстрагированный раствор сыворотки). Растворение ЕДТА облегчается при слабом нагревании. После охлаждения до комнатной температуры этот раствор добавляют в элюат колонки(экстрагированнь и раствор сыворотки).Затем к злюату добавляют еще радиоактивный тироксин (около 0,27 мкл) . Зкстрагированный раствор сыворотки затем пропускают через фильтр 0,22.

Затем отмеряют 11,580 мл буферного барбитального раствора, содержащего 0,1 мг/мл динатриевой соли ЕДТА, что равно шестикратному объему элюата. Затем этот раствор добавляют к элюату, что обеспечивает шестикратное разбавление элюата. Полученный реагент имеет рН 8,6, концентрация двуиатриевой соли ЕДТА составляет

0,1 мг/мл.

Раствор сывороточного тироксина приготовляют следующим образом.

Отбирают около 10 мл испьпуемой крови и ей дают коагулировать. Удаляют сыворотку и го каплям добавляют 1,0 мл сыворотки и 2 мл 95%-ного этанола в пробирку для центрифутирования.

Содержимое тщательно смешивают в скоростном смесителе для денатурирования протеинов.

Затем спиртовую смесь центрифугируют до уплотнения выпавшего йротеина на дне пробирки (2000 — 2500 об/мин) в течение 4 — 5 мин. Полученный верхний слой спиртового раствора, несодержащий протеинов, содержит около 80% от всего тироксина в пробе. Затем готовят раствор сывороточного (TBG) глобулина для связывания тироксина. Для этого порщпо испытуемой сыворотки (0,20 мл) добавляют к 4,0 мл барбитального буфера с рН 8,6 (получен как меченый реагент Т4 TBG) .

Этот раствор поставляет ненасыщенный TBG пз испьпуемой сыворотки. Вместо буферного раствора можно применять раствор в простой воде меньшего количества сыворотки, например 5 или

10 мкл. На каждый коьшлект испытуемой сьлоротки обрабатывают контрольную сыворотку точно таким же образом, как и испьгтуемую сыворотку, включая приготовление растворов (контрольного) сывороточного тироксина и глобулина, связапхого о тироксином. Контрольная сыворотка — это промышленная нормальная сыворотка, содержащая нормальные количества тирокснна н глобуппи, связанного с тироксином.

Аликвоту раствора сьтвороточного ироксина (30 мл) добавляют к 4,0 мл меченого реагента тироксина и глобулина, связанного с тироксином в сосуде. Сосуд закупоривают и растворы хорошо перемешивают. Затем к смеси растворов тироксина и реагента добавляют аликвоту (0,10 мл) раствора сывороточного глобулина, связанного с тироксином.

В сосуд со смесью трех растворов помещают полоску диска ионообменной смолы.

После помещения полоски смолы сосуды со смесями и контрольной сывороткой закрывают колпачками и центрифугируют в течение 1ч при кометной температуре. Поскольку поглощение радиоактивного тироксина смолой является функцией времени вращения важно, чтобы время вращения было одинаково как для испьп ммои пробы, так и для контрольной. По истечении 1 ч вращения полоску смолы удаляют пинцетом и выбрасывают. Затем счетчиком определяют концентрацию меченого тироксина. В каждом сосуде должно быть не менее

10.000 счетов. Затем рассчитывают индекс, означающий эффективное тироксиновое отношение, следующим образом:

Счет/мин для контрольнои сыво отки — он

25 Счет/мин для испытуемой- сыворотки — фон

Состояние гормона щитовидной железы в пробах сыворотки от 209 пациентов было установлено с помощью метода Беттингера, поглощения 3,3 5-трийодтиронина и пробы Броуна на сывороточный тироксин, а также метода эффективного тироксинового отношения. По результатам обычных анализов рассчитан индекс свободного тироксина. Кроме того, производилась клиническая оценка функции щитовидной железы у каждого пациента.

Все пациенты в этом испытании были разделены на 5 групп на основе истории болезни, клинических наблюдений и результатов опытов:

1. Неосложненная нормальная функция щит

4 видной железы (128) .

2, Не осложненная гипофункция щитовидной железы (9).

3. Неосложненная гиперфункция щитовидной железы (14).

45 4. Нормальная функция щитовидной железы у беременных (37), 5. Нормальная функция щитовидной железы цри лечении экстрогенами (21) .

Всего: 209.

Из результатов обследования можно сделать следующие выводы. В группе 128 пациентов неосложненной нормальной функцией щитовидной железы во всех опытах и по индексу свободного тироксина обследование показало, что у всех па55 циентов щитовидная железа работает нормально, крома 4-х случаев, когда по пробе на сывороточный тироксин была установлена гипофункция щитовидной железы и по индексу свободного тироксина была установлена гипофункция щитовидной желеЯ) зы. б07 g

11ределы Эффективного тироксннового Отношения

1 HrIooôóILñ-дия щитогиднoA 1 11ОО>i.",.11ытая + - Lgöò ) 1 ппофункшгня щ>гговидной ксттеы (гцитовидной -;елезы (железы

0,85 — !,15

Яолее 1,15

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

1 е "рад О. Лугов ля Корректор С. Патрушева

Редактор 31. 1. гиельяиова

Тираж 1101 Полни снос

ЦНИИПИ Государ.-твенного когиитста Совега Министров ГССР по делам изобретений и оз крь тий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская изб.;.. 4 б

Заказ "949 701

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

В lрунпе 9палснгoB с неосложнеиной гипофуНКцИЕй щнтОВИдлой ЖЕЛЕЗЫ ВСЕ От1ЫтЬ1 И ИНДЕКС свободного гироксина показали, что все пациенты

Отличаются гипофункцчей щитовидной железы,. кроме одного случая, когда у одного пациента пб пробе на поглоще>п4е 3,3 5 - трийодтиронина установлена нормальная фушсция щитовидной железы.

В группе 14-и пациентов с неосло>кненной гиперфункцией щитовидной железы все пробы и индекс свободного тироксина показа>п1, mo все пациенты отличаются гиперфутпсцией щитовидной железы, кроме одного случая, когда у диого пациента по пробе поглощения 3,3 5 - трийодт>ироника была установлена нормальная футпсщтт щитовидной железь1, у 2 пациентов по пробе на тироксин была установлена нормальная фу>псция щитовидной железы, у 2 пациентов была установлена иоомал ная функция щитовидной железы по индексу свободного ти рок сина.

B группе 37 пациентов с нормальной оь;ч>к и щитовидной железы во время береме>п .Ости. тслько у 1 пациентки по пробе на поглощеш1е 3,„ ",5

"трийодтиронина была установлена нормгльная функция щитовидной железы, а у всех остапы ых пациентов по этой пробе установлена г>гпофун1сция щитовидной железы. По пробе на тироксин у 4 пациентов из 37 была установлена гтшофупкция щитовидной железы, в то время как у осталып=1х

1. Способ определения эффективного гlpoxcнновогс отношения в пробе крови, î — л и:: а -ощий ся тем, что смешивают раствор меченого гормона щитовидной железы с двумя порциями сыворотки крови, первая из которых по существу свободна от глобулина, связывающего тирокспн, а вторая содержит ненасыщенный глобулин, связывающий тироксин, выдерживают в контакте с ионоОбменнОН смолой, после чего определяют Отпогце3,";-. „.:,.:циснтов ь больипшстве случаев уровень сызорото п1ого тироксцна был повышен, но в пределах для нормальной функш и щитовидной железы.

По индексу свободного тирокспна и по эффект1твному тироксяновому отношению по изобретению у всех 37 пациентов установлена нормальная функш я щитовидной железы.

В группе 21 пациента, получавших лечение экстрогенаьа"., только у 3 была установлена нормаль1О ная функция щитовидной железы по поглощению

3,3,5 - трийодглротптна, в то время как у остальных

18 цатд4ентов по этой пробе была установлена гипофуькция щитовидной железы, по пробе на тироксин у 3 пз 21 пациентов была установлена гипер16 футпсцня пцгговидной железы, в то время как уровень сыворото диого тироксина у остальных

18 пацнентов в большинстве случаев был повышен, пс в пределах нормальной функции щитовидной железы.

По индексу свободного тироксина и по эффективному тпроксиновому отношению по изобретешпо у всех 21 пациента установлена нормальная функция щитовидной железы.

Согласно II306pc TQIIIIIo, клинические показания состояния щитовидной железы по эффективному тпрокспновому отношению можно устанавливать по пределам, указанным в таблице.

Ki ко.тпчества меченого ropMoHB щитовидной >келезы, связанного с глобулином, к количеству ме =ного гормона щитовидной железы, не связанного

С ГпоаУЛИНОМ.

2. Способпоп. l,îòëè÷àþùèéñÿ тем,что меченый гормон щитовидной железы содержит радиаактивнь1й йод.

3. Способпоп. l,îòëèчающийся тем,что отношение объема первой порции сыворотки крови (без глобулина) к второй порции сыворотки крови (с глобулином) составляет 10:1 — 30:1.