Раствор лизата

 

ОП-ИСАНИЕ

Союз Советских

Соцмалнстическнх

Республик

И ЗОБ РЕТ Е Н ИЯ

К llkTEklV (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 16.07.75 (21) 155471/ 8-13 (51) М Ил а

А 61 К 35/5о (23) Приоритет (31) 489224 (32) 17.07.74 (33) США

Государственный камнтет

Совета й1нннатрав СССР аа делам нзобретеннй н аткрытнй (53) УДК

616.07 1 (088.8) (43) Опубликовано 15.04.78. Бюллетень № 14 (45) Дата опубликования описания 13.03.78

Иностранец

Роберт Е. Хопкинс (СЫА ) (72) Aвторы изобретения

Иностранная фирма

"Балстер Лабора 1ориэ", Инк

1СЙА) (71) Заявитель (54) PACTBOP ЛИЗАТА

Изобретение относится к области меди1шны и может быть использовано для,диагностических целей.

Известен раствор лизата на основе растворимых белков кровяных клеток Zimulus (1). 5

Однако известный раствор не обладае1 высокой чувствительностью к эндотоксииу.

Цел1 ю изобретения является повьниение чувствительности к эндотоксину.

Эта пель достигается тем, что он дополнитель- 1О но содержит по крайней мере один компонент, выбранный из следующих групп: ионогепное соединение магния, лития, стронция, бария, имидазола, цис теина в концентрации 0)005 — О,З моль/л раствора.

Эти компоненты могут рисутствовать в раство-15 ре лизата в следующих концентрациях: имидазол

0,004 — 0,4 моль/л, предпочтительно 0,01 — 0,3 моль/л, марганец, предпочтительно в виде ионов (Мп ) в количестве 0)005-0,1 моль/л, ионы стронция (Sf ) обычно 0,005 — 0,4 мол.!11, предпочтительно

Фф

0)01 — 0,3 моль/л ионы бария (Ва ) обычно 0,005—

0,5 моль/л в присутствии буфера для создания рН 7 — 10, цистеин — обычно в концентрации 0,005—

0,3 моль/л) ионы лития (4i ) 0.005--0,3 мОль/:1, предпочтительно 0,3 — 0,15 моль/л.

Ионы магния сами по себе обеспечивают хорошую чувствительность протеина Limu1us, если они присутствуют совместно с ионами натрия (не более чем 0,1 моль/л ионов натрия), которые проявляют чувствительность лизатного протеина по отношению к эндотоксину, даже в присутствии других катализаторов. Предтточтительно, чтобы в литре раствора присутствовало от 0,5 до 0,3 моль/л Mg +

Предпочтительно имидазол использовать в раем творе лизата совместно с ионами 1 <, ионами Mg, тиогликолят ионами (которые мо. ут быть добавлены в виде тиогликолята щелочного металла, напри++ мер тиогликолята натрия) или ионами Sr . Комбинация этих ионов с имидазолом, действующая как буферньпт агент, обеспечивает высокую чувствительность лизата на присутствие эндотоксина.

Например, при использовании совместно с имидазолом, взятом в предпочтительном интервале кон-пе11тра1гий,. приведенном выше, хорошие результаты получают в результате добавления 0 005-03 моль, л ионов L f, предпочтительно 0,2--0,15 моль/л ио Ф нов 1 < или 0,005 — 0,3 моль/л ионов Mg прел+ 44попитсльно 0,01 — 0.1 моль/л ионов Mg

4+

Хорошую комбинацию получают., если имилаэол и ионы Mg добавляют в их предпочтительных

ЮЗЗ20

3 концентоациях, а ионы тиогликолята добавляют с концентрацией 0,005 — 0,008 моль/л раствора.

Хорошие результаты получают при добавлении к имидазольному раствору ионы стронция Sr в

++ концентрации 0,02 — 0,15 моль!ц. б

Приведенные выше положительно заряженные ионы можно добавлять к раствору в виде соответствующих хлоридов.

Ионы стронция обычно добавляют в виде хлорида стронция, ионы бария (Ва используют сов++ местно с буфером и эквивалентными буферными агентами, особенно в том случае, когда буфер присутствует в такой концентрации, тгобы обеспечить рН 7 — 10.

Известны и эквивалентные сульфогидрильны 1б соединения, такие как глютатион, тиогликоляг щелочного металла или тиоурацил, проявляннцие сно собность повышать чувствительность лизата. Хорошие результаты получают тогда, когда гидрохлорид цистеина нейтрализуют до рН 6 — 10 щелочным ве- 0 ществом, таким как гидроокись натрия, карбонат калия, гидроокись тетрабутиламмония, а также при использовании в растворе лизата 0,02 — 0,2 вес.% сульфогидрилсодержащего соединения, такого кав цистеин или 1иогликолятная соль щелочного метал- б ла, 0,2 — 2 вес.% воднорастворимой соли магния, та. кой как хлористый магний.

Ионы лития вводят с хлористым литием или подобными солями лития, имеющими растворимый анион, для повышения чувствительности, 30

Каталитические или повьппающие чувствительность агенты используют путем первоначального растворения в дистиллированной воде в желаемых концентрациях. После этого полученные растворы используют для перестройки лиофилизированного лизата путем растворения лизата в этом растворе.

Растворы лизата обычно готовят непосредственно перед использованием из-за их повышенной чувствительности по отношению к эндотоксину, которая повышает вероятность их осаждения и -за на- 40 личия случайных примесей, что имеет место при длительном хранении.

Раствор лизата — это водный раствор, свободный от пирогенов, использование которого позволяет избежать преждевременного осаждения лизата, 45 однако могут быть использованы и неводные растворители, такие как метанол, этанол, изопропанол, ацетон, этиленгликоль и другие, которые могут также использоваться в смеси с водой, при необхо димости. 50

Пример 1. Собирают Атлантических мечехвостов (Limulus polyphemus) и помещают их в штатив таким образом, чтобы удерживать в положении, при котором их брюшные стороны находятся сверху. Стык между двумя первыми сегментами бб крабов (простома и опситома} подготавливают в результате протирания спиртом. Затем в место сочленения вводят иглу для отбора крови, которую устанавливают на конце сосуда для крови, но модифицированной таким образом, что трубка для 60

4 отбора крови имела длину в 5 дюймов (12,5см).

Сосуд содержит 300 мл 3%-ного раствора хлористо

ro натрия, в котором растворено 2,87 г этилендиаминтетраацетата (ЕДТА) .

Иэ мечехвостов отбирают в сосуд для сбора крови 300 мл крови. с4ва сосуда выбирают и балансируют, если это необходимо по весам и затем помещают в центрифугу на 7 мин прн 17.800 об/мин для того, чтобы отделить клетки амебоцита от крови, В тех случаях, когда кровь хорошо седиментирована, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 7 мин, Вслед за стадией центрифутировання клетки каждъй сосуд с кровью помещают на наклонную плоскость с углом наклона 10 таким образом,. чтобы закупоренный конец трубки для сбора крови был направлен вниз и трубку для сбора крови еще раз открывают, разрезая åe. Верхний слой пцательно декантируют, оставляя осажденные клетки и сосуде, Вслед за стадией декантации трубку для сбора снова запаивают.

Затем в одну из ° двух стерильных дополнительных частей сосудов с кровью вводят с помощью инъекционной иглы 6 вес.ч. дистиллирован ной, непирогенной воды на каждую 1 вес.ч. клеток, присутствующих в сосуде для осуществления лизиса клеток. Вес клеток может быть определен в результате вычитания стаццартнаго сухого веса сосуда для крови от действительного веса сосуда и клеток, которые содержатся в нем. Ьстиллированную воду перемешивают в сосуде для крови и затем дают стоять в течение 24 ч при 4 С. Затем сосуд центрифугируют в течение

7 мин. После этого жидкое ."îäåðæèMoå каждого нз сосудов пропускают через 170-микранчый фильтр для отделения его от осажденных твердых веществ и помещают в замораживающую среду для получе. ния твердого замороженного состояния, Замороженный Llmulus лизатньй раствор затем пцательно оттаивают, обеспеивая такой режим, чтобы раствор оставался холодным (r.e.íèæe

20 С), После оттаивании лизатный раствор перефильтровывают в колбу через дополнительный

170- микронньй фильтр.

Осадок на фигп тре„остающийся после фильтрования, представляет собой нежелательный материал, который осаждается во время стадии вымораживания, Затем фнльтрат обычно отфильтровывают еще раэ через другой фильтр {имеющий номинальный размер пор порядка 1,5 мкм с последующей филь. трацией через мембранный фильтр, который имеет абсолютный размер пор порядка 1,2 мкм и номинальный размер пор менее этого значения.

Перед использованием все фильтры промывали 1 л стерильной непирогенной воды. Последние стадии фильтрации осуществляют в результате сжатия лизатного раствора в направлении течения через фильтр при помощи давления газообразного

\ г азота, равного приблизительно 0,9 кг/см . C другаи

603320

1,56 (раствор И4 7)

0,39 (раствор И 9)

0,195 (раствор И 10)

0,39 (раствор И 9)

0,195 (раствор Р 10);

0,097 (раствор И 11}

0,097 (раствор И 11}

0,195 (раствор И 10}

0,195 (раствор N 10) 0,195 (раствор И 10)

0,39 (раствор И 9) 5 стороны, в сборном сосуде можно применять вакуумирование для облегчения фильтрации.

После последней стадии фильтрации раствор разделяют на 2,0 аликвоты, которые помещают в

6 мл ампулы или испытательные пробирки, которые тщательно промывают стерильной, не содержащей пирогенов водой, и депирогенируни при температуре 245 С в течение 4 ч. Испьпательные пробирки затем запаивают, подвергают полочному вымора

a0tBaHHlo в машине для лиофилиэации H сушат На . холоду до образования сухого порошка.

Ряд испытательных пробирок, приготовле:!ных как описано выше, подвергают перестройке в виде раствора в результате добавления 5 мл одного иэ растворов, списанных ниже. 5

В каждой серии пустых испытательных пробирок, эа исключением первой пробирки каждой серии, добавляют 0,1 мл непирогенной воды. В первую пробирку добавляют 0,2 мл Е.cori стандартного зндотоксинного раствора. Концентрация исполь-. о зуемого Е боб эндотоксина доставляет 100 нанограмм эндотоксина на 1 мл. После этого 0,1 мл раствора . из первой пробирки добавляют во вторую пробирку; 0,1 мл раствора из второй пробирки добавляют В третью пробирку; и такое добавление продол 25 хают до образования серий последовательных испытательных растворов, каждый из которых содержит половину концентрации предыдущих испытатель ных растворов икнм образом, что лвадцатый и по09 йаО (контроль)

0085 цистеина НС

0,1 цистеина

0,001 реагента Клеланда

0,2 2- тио-6-амнноурацнла

Смесь равйых объемов: 1 раствора Mg С и 0,85 цистеина НС

Смесь равных объемов: 1 раствора Mg Cl и 0,1 цнстеина

Смесь равных объемов: 1

M gCQ и 0,1 раствора тногликолята натрия

Смесь (3:2):1 раствора

Mg С!э и 0,1 раствора тиоглнколята натрия

Смесь (2:1:1):1 раствора

Mg CI>, 0,9 раствора

СаГ1 и 0,85 раствора ! -:цистенна НО

Смесь равных объемов:1

Mg $04, 0,2 2-тио-6-аминоурацила и 0,1 тиогликолята натрия

6 следний испьпательный раствор содержал 000019 нанограмм эндотоксина на 1 мл.

К каждому выбранному интервалу раствора в полученных пробирках добавляют 0.1 мл персстроснного лизатонного раствора.

Серии пробирок затем инкубируют при температуре 37 С в течение 60 мин. Затем каждую пробирку переворачивают и отмечают наличие или отсутствие неповрежденного тромба протеина. Íaличие протеинового тромба, способного оставаться неразрушенным s результате мягкой инверсии испытательной пробирки, служит указанием полово!тельной чувствительности реакции лизета на эндотоксин.

Ниже показано, что природа перестраивающе. го раствора в значительной степени влияет на чувствительность лиэата по отношению к эндотоксину представлены различные перестраиваяяцие pansoры, которые подвергают испьпанию и перечислены для каждого слувя максимально разбавленные рас. творы эндотоксин!, которые стикс збны вызывать положительную реакцию на прочность тромба Limvtus лизатом! после перестройки в специальных растворах, перечисленных киже.

В целях сравнения, при испьпании на кролике для парентеральных pacraopoa больших объемов обычный предел детектирования составляет 0,097 нанограмм эндотоксина на 1 мл. (Phcrsop 11).

Низшая концентрация эндотоксинного раствора, способная давать положительную реакцию на прочность тромба, (наиограмм/мл) 0,097 (раствор Ие 11) иногда

0,048 (раствор И 12}

6ОЗЗ20 концентрациях, указанных ниже.

Добавки в используемый перестраиваинций раствор

Стерильная вода (контроль) без имида зола

Без добавок — только имидазол хПовторение этого эксперимента с использованием 12М стерильного имидазольного раствора (pH 7,07) привело в результате к положительной реакции на тромб при концентрации эндотоксина порядка 0,048 нанограмм/мл (раствор N 12).

0,097 (раствор N 11)

0,048 (раствор Ио 12)

0,048 (раствор Р 12)

0,097 (раствор N !)

0,048 (раствор Р 12) 0,2М SrCIz

0,1M SrCI

0,05М ЯгС1

0,025М SrCtz

0,0125М Ь С!г

Йизшая концентрация эндотоксина, способная давать положительную реакцию на прочность тромба, нанограмм/мл

Дополнительные инградиенты пере странна ющего раатв ора

Без добавок — только имидазол

0,097 (раствор N !1)

0,048 (раствор N 12)

0,048 (раствор N 12)

0,048 (раствор И 12).

0,005М тиогликолята натрия

0,0025М тиогликолята натрия

0,00125М тиогликолята натрия

Пример 2. Образцы различной партии лиофилизированного Limulus лизата, полученного в примере 1, подвергают перестройке по способу, описанному в примере 1, с помощью 2 мл перестраиваю0,1 M LiCI

0,5 М LiCI

0025M LiCI

0,0125М LiCI

0,2М Licl

01М М9С4

005M Mg Ctz

0025M Mg Ctz

0,125М Mg С1

0,00625M Mg Ctz

Пример 3. Образцы лиофилизированного

Limulus лизата, полученные согласно примеру 1, подвергают перестройке способом примера 1 с помощью 2 мл перестраивающего раствора, включающего раствора, состоящего из 80 об.,"ь стерильной воды и 20 об.% 0,.13 имидазольного.буфера (pH 6,8!. и включающего также дополнительные добавки в

Низшая концентрация раствора эндотоксина, способная давать положитель-. ную реакцию на прочность тромба, наног рамм/мл

3,12 (раствор N 6) и иногда

1,56 (раствор И 7)

0,195 (раствор N 10)

0,097 (раствор И ll) и иногда

0,048 (раствор N 12)

0,097 (раствор N 111 (p c вop N0 11)

0,097 (раствор N 11)

0,097 (раствор И 11)

0,097 (раствор Ио 11)

0Ä048 (раствор N 12)

0,048 (раствор N 12)

0,048 (раствор N 12)

3,097 (раствор И !1) I щего в свой состав 0,12М имидазола (рН 7,04), а

45 также включающий дополнительные инградиенты в концентрациях, указанных ниже.

603320 раствор

Стерильная вода

0,195 (раствор И 10)

0,097 (раствор И 11) 0,048 (раствор N 12) 0,195 (раствор И0 10) 0,097 (раствор И 11) 0,097 (раствор И 11) 0,097 (раствор И0 11) 0,097 (раствор И0 11) 0,097 (раствор N 11) 0,097 (раствор N 11)

0,195 (раствор N 10)

0.097 (раствор N 11)

0,195 (раствор N 10)

0,097 (раствор И 11)

0,097 (раствор И0 11)

0,097 (раствор N 11) 0,048 (раствор И 12) 0.048 (раствор И0 12) 0,39 (раствор N0 9)

0.195 (раствор И 10) 0,097 (раствор N 11) 9

Пример 4. Образцы лиофилизированного

LImuius лизата, полученные как описано в примере

1, подвергают перестройке способом примера 1 с

Используемый перестраивающий

0,1М Mg Cl, 0,1М имидазола и

0,005М тиогликолята натрия, 0,05M Mg С1г, 0,05М имидазола, 0,0025М тиогликолята натрия

0,025М Mg С!„0,025М имидазола и 0,00125М тиогликолята натрия

0,0125M Mg С1,; 0,0125М имидазола и 0,000625М тиогликолята натрия

0,05M MgClq, 005M LiCI, и

0,05М имидазола

0,025М Mg С!г, 0,025М LICI и

0,025М имндазола

0,1М Mg Cl ; 0,1М LICI ;

0,1М имидазола и 0,005М тиогликолята натрия

0,05М Мц CI2,005M LiCI2, 0,05М имидазола и 0,0005М тиогликолята натрия

0,025M Mg CI2, 0,025M LiCI;, 0,025М имидазола и 0,00125М тиогликолята натрия

0,1М LiCI2, 0,1М имидазола и

0,005М тиогликолята натрия

0,0005М то же

0,00025M то же

0,0000625 то же

0,2М SrCI

0,5М ЯгС!г

0,0125M SrCI

0,2М 5гС!г в растворе трис-буфера при рН 9,3

0,1М SrCI: в растворе трис-буфера с рН 9,3 .

Раствор трис-буфера (контроль для данных по влиянию SrCI, (рН 9,3)

0,2М BaCI2

0,05М BaCI2 в растворе трис-буфера (рН 9,55) помощью 2 мл различных перестраивающих растворов, как описано ниже.Знцотоксинная чувствительность по лученных в результате продуктов представлена ниже

При концентрации 0,78 (раствор И0 8) не удалось получить положительную реакцию

603320

Продолкенис 1аблицы

0,097 (раствор N )1) 0,195 (раствор И 10) 0,39 (раствор И 9) (раствор N 10) (раствор И" 10) (раствор И 11) (раствор N 11) (раствор Иа 10) 0.195

0,195

0,097

0,097

0,195

0,097 (раствор И l 1) 0,097 (раствор Иа 11) 0,195 (раствор N" 10) 0,195 (раствор И 9) 0,097 (раствор И 11) 0,048 (раствор N 12) 0,097 (раствор N 11) 0,097 (раствор И 11) Составитель C. Малютина

Техред O.Àíäðår>êî

Редактор Н. Потапова

КоРРектор I Палл

Заказ 1666/62

Тираж 703

11НИИПИ Государственного комитета Совета Министров (:(CP по делал1 изобретений и открытий

113035, Москва, Ж -35. рау>нская наб., д 4/5

Подписное ч>илиал ППП "Патент" . г. Ужгород. ул Проси глав. 4

0,025М BaClz в растворе трис-буфера (рН 9,55)

0,00625 М ВаС>г в растворе трис-буфера (рН 9,5)

Трис — буфер (контроль для данных по влиянию BaCI, (pH 9,55)

0,02М цистерн HCI, нейтрализованный до рН 7,15 5%-ным раствором NaQH

0 2М 1- - г

0,1М LiCIг

0,05М LICI

0,025М LICI

0,2М 1.iCIz в растворе

Трис-буфера (рН 9,55)

0,05M LiCI, в растворе

Трис-буфера (рН 9,55)

0,0125M LICI> в растворе

Трис-буфера (рН 9,55)

Раствор трис-буфера (контрольньй для данных по влиянию l >С1г (pH 9,55)

0,0125M Mg CI в стерильной воде (01 моль/и ионов Na+

0,05M Mg С1г в стерильной воде и<

0,1 моль/л ионов Ма+

0,2M Mg Cl> в стерильной воде и

0,1 моль/л ионов Na+

0,05М Mg CI> в 0,0125%-ном растворе трис-буфера (pH 8,10) и< 0,1 моль/л ионов йа+

Предлагаемый раствор лизата обладает высокой чувствительностью к зндотоксину.

Формула изобретения, Раствор лизата на основе растворимых белков кровяных клеток Lirnuius, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности к эндотоксину, он дополнительно содержит по крайней мере один компонент выбранный из следуцицих групп: иогенное соединение магния, лития, стронция, бария, имидазола, цистеина в концентрации

0,005 — 0,3 моль/л раствора.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Bulletin of the Parenteral Drug Association, m. 27, И 3, р. 39 — 148, 1973.