Способ получения иммобилизованных нуклеиновых кислот

 

Ъ

ОП ИСАНИЕ

И ЗОБРЕТЕ Н ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлеио09. 11,76 (21) 2418988/23-04 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано05.08.78.Бюллетень № 29 (45) Дата опубликования описания 27.06.78

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 618380

2 (51) М. Кл.

С 07 Н 21/00

Государственный комнтет

Совета Мнннотроа СССР

IN делам нэебретеннй н открытнй (53) УДК 577.15. .07 (088.8) Б, М. Куриненко, Ф. Ф. Шаги-Мухаметова и P. Э. Давыдов (72) Авторы изобретения

Казанский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. В. И. Ульянова-Ленина (73) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ

НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Изобретение относится к способу полу чения иммобилизованных на нерастворимом носител е нуклеино вых кислот, которые могут быть использованы для афинной хроматографии ферментов и белков, образующих комплексы с нуклеиновыми кислотами.

В литературе описан ряд способов получения препаратов иммобилизованнь1х нуклеиновых кислот при помощи ковалентного связывания с различными носителями (1

При помощи указанных методов возможна иммобилизация как одноцепочечHblx нуклеиновых кислот (PHK или денату-рированная ДНК), так и двуцепочечных.

Эти м етод ы являются двустади йн ь ми: первая стадия — активация носителя или нукчеиновой кислоть, вторая - взаимодействие носителя с нуклеиновой кйслотой.

Известен также 5 -триа зиновий способ иммобилизации нуклеинбвых кислот, позволяющий осуществить ковал ентное связывание. с носител ем, представляющим собой полимер декст рана — сефадекс как одноцепочечных нуклеиновых кислот (РНК или денатурированная ДНК), так и вцоль . цепи нативной (двуцепочной) ДНК (21

В соответствии с этим методом связывание производят следующим образом.

К носителю (сефадекс), отмытому водой и 0,1 М боратным буфером, добавляют раствор цианурхлорида в ацетоне, Активацию носителя проводят в течение

30 мин на холоду, стабилизируя рН добавлением 4 н. й) аОН. Активированный носитель промывают раствором ацетона, дистиллированной водой,- боратным буфером и приливают раствор нуклеиновой кислоты. Стадию связывания нуклеиновых кислот проводят при перемешивании в течение 16 ч. Для удаления непрореагировавших высокореактивных хлоридных групп цианурхлорида полученные препара20 ты промывают 1 М аммиачньг буфером.

С помощью этого метода возможно получение препаратов, содержащих достаточно большое количество нуклеиновых

25 кислот, превосходящее содержание нукле.

Э 618380 4. иновых кислот, иммобилиэованных другим и метода ми.

Однако этот способ имеет ряд недостатков, В ряде случаев количества нуклеиновых кислот, содержащихся в иммобилизованнь|х препаратах, бывает недостаточно, и такие препарать1 обладают малой сорбционной емкостью.

Кроме того, как и другие способы иммобилизации нуклеиновых кислот, б -триаэиновый способ также двустадиен и включает стадии активации носителя и взаимодействия активированного носителя с нуклеиновой кислотой.

Целью изобретения является упрощение процесса .и повышение выхода целе- 1 вого продукта, Укаэанная цель достигается за счет того, что в качестве носителя используют растворимый полимер декстрана-полиглюкин. 20

Способ обычно осуществляют следующим образом.

Раствор нуклеиновой кислоты смешивают с растворимым полимером декстрана (полиглюкин), полученную смесь обра- Zs батывают цианурхлоридом, что приводит к иммобилизации нуклеиновой кислоты на носителе, При этом комплекс нуклеиновая кислота-носитель переходит в нераст -! воримую форму. 30

Весовое соотношение нуклеиновая кислота /полиглюкин обычно равно 1:300 и выше в сторону увеличения содержания нуклеиновой кислоты.

Весовое соотношение связанные поли- з меры/ пианурхлорид чаще всего составляет 2:1.

Количество связанных нуклеиновых кислот определяют по содержанию неорганического фосфора в полученных пре- 40 паратах.

При излучении влияния соотношения нуклеиновая кислота/полиглюкин в реакционной смеси на выход конечного продукта (иммобилиэованной кислоты) пока- 45 зано, что он не зависит от соотношения.

Это дает возможность, применяя пред лагаемый способ, получать препараты ссодержанием в них .нуклеиновых кислот, значительно превышающим то, которое 50 указано в приведенном ниже примере, и зависящим только от исходного количества нуклеиновой кислоть1, взятой для иммобилизации.

Таким образом, предлагаемый способ 55 является экономически более выгодным

LIHHHfIH Заказ 4204/21

Филиал ППП Патент, г. по сравнению с прототипом, так как значительно проще в технологическом соотношении и позволяет получать препараты с большим содержанием нуклеиновйх кислот.

Пример . 300 мг полиглюкина растворяют в 3 мл 0,1 М боратного буфера (рН 9,2), приливают 3 мл раствора

ДНК или PHK (2-6 мг/мл в 0,14 М

Я аС ), осторожно перемешивают и выливают в чашки Петри. Далее цобавляют по каплям 1,5 раствора цианурхлорида в ацетоне (100 мгlмл). Реакцию проводят в течение 30 мин при комнатной температуре, поддерживая рН. в пределах 9,2 добавлением буфера, Образовавшийся бель и гель отмывают

100 мл смеси ацетона с дистиллированной водой (1:1) и 100 мл0,1 М боратного буфера.

Содержание нуклеиновых кислот в препаратах, полученных при данном соотношении нуклеиновая кислота/полиглюкин, составляет 20-25 мг на 1 r геля. Это соответствует 80% исходного количества нуклеиновой кислоты, взятой для иммобилизации, и примерно в 2 раза превосходит содержание нуклеиновых кислот в препаратах, полученных по известному методу. формула изобретения

1. Способ получения иммобилизованных нуклеиновых кислот путем ковалентного связывания с носителем, представля ющим собой полимер декстрана, при помощи цианурхлорида, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта, в качестве носителя используют растворимый полимер декстрана - полиглюкин, 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю— шийся тем, что весовое соотношение нуклеиновая кислота/полиглюкин составляет 1:300 и выше в сторону увеличения доли нуклеиновой кислоть1.

З.Способпопп. 1и2, отлич а ющ и йс я тем, что весовое соотношение связанные полимеры (нуклеиновая кислота и полиглюкин)/цианурхлорид составляет 2:1, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1.9iOehe mi etvy,Ч.1О, ИОЭ

Р. 424-427, 1974.

2. Авторское свидетельство СССР

Х 462824, кл. С 07 33 473/00, 27.04.7 3.

Тираж 559 Подписное

Ужгород, ул. Проектная, 4