Способ выделения биологически активной фракции из семенной жидкости животных

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскик

Социалистических

Республин (11) 622468 (61) Дополнительное к авт. свил-ву(22) Заявлено гы776 (21) 2389766у3()-Z5 с присоединением заявки № (23) Приоритет(43) Опубликовано 050978, Бюллетень № 33 (45) Дата опубликования описания 2ОО778 (о1) М. Кл.

А 61 К 35/52

Государственный комитет

Совета Министров СССР но делам изобретений и открытий (53) УДЦ6>X.Oa3..>Х (088. 8) В.A.Èèðîíîâ,B.A.Ïàíêðàòîâ,С.П.Попов,O.Н.Владимиров, A.Ñ.Ìàêååâ, A.A.ÍåùàäèH,Ë.Â.Èèðîíîâ и А.A.Apuac (72) Авторы изобретения

Московский технологический институт мясной и молочной промышленности и Московский ордена Октябрьской Революции мясокомбинат (71) Заявители (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ФРАКЦИИ

ИЗ СЕМЕННОЙ ЖИДКОСТИ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к способам выделенйя биологически активных биогенных веществ, в частности к извлечению биологически активной фракции семенной жидкости животных. указанная 6 фракция может найти применение в животноводстве,например,для синхронизации половой охоты домашних животных.

Известен способ выделения фракции простогландинов (ПГ) из предста- 10 тельной железы баранов tlj .

По этому способу ПГ выделяют из замороженных предстательных желез баранов путем многократной экстракции эфиром, многоступенчатого про- .LS тивообмена между эфирной и буферной фазами и хроматографического разделения с промежуточным вакуумным упариванием экстрактов.

Недостатком указанного способа. а0 извлечения биологически активных фракций является его сложность и наличие большого числа технологичес,ких операций, что не позволяет нсцользовать его в крупном, масштабе. 25 Цель изобретения - упрощение cIIQсоба без снижения биологической ак- тивности получаемой фракции.

Это достигается тем, что перед экстракцией к семенной жидкости добавляют этанол, декантируют водноспиртовую смесь и подвергают ее обработке гидроокисью кальция, полученный осадок регенерируют кислотой при одновременном добавлении к нему эфира для проведения активной фракции.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Семенную жидкость заливают этанолом, перемешивают и отстаивают. Водно-спиртовую смесь после декантации и промывки концентрируют вакуумным упариванием приокомнатной температуре. Упаренный раствор обрабатывают гидроокисью кальция и отделяют осадок от раствор@. Сухой осадок регенерируют соляной кислотой с одновременной экстракцией эфиром. Эфирный раствор жирных кислот после отделения и высушивания упаривают. в вакууме и последовательно подвергают фракционному разделению в хроматографической колонке, Отбор фракций на колонки ведут элюэнтом,„ содержащим бензолФтилацетат-метанол в разных соотношениях.

Известно, что сами ПГ трупп Е и Г обладают слабым поглощением в УФспектре. Однако при длительном нагревании . и .присутствии щелочи они изо622468 меризуюгся в ПГ типа В, молекула которых содержит сопряженные С О и С=С связи, что обуславливает появление максимума поглощения в УФ-спектре.

При поглощении ПГЕ в УФ-спектре соответствует 278 нм.

Испытание биологической активности получаемых фракций проводят на изолированном отрезке гладкомышечной ткани.

При сравнении способов извлечения биологически активных фракций из семенной жидкости животных по известному и предлагаемому способу видно, что последний является более простым, так как исключает многократную экстракцию эфиром и многоступенчатое распределение между эфиром и буфферным раствором, а также существенно снижает расход реагентов.

Одновременно сохраняется биологическая активность получаемных фракций

ПГ

Пример 1. Нанеску семенной жидкости баранов н количестве 50 r помещают н колбу емкостью 0,5 л с мешалкой и разбанляют 150 мл 95Ъ-ного этанола, затем перемешивают в течение 1 ч, после чего смесь отстаивают 30 мин, водно-спиртовой раствор отделяют декантацией, Остаток промывают при перемешинании 150 мл 95Ъного этанола н течение 30 мин и центрифугируют. Обьединенные водноспиртсные экстракты упаринают н вакууме (20 мм рт.ст., 23 С) до объема

30 мл. К упаренному pàñòâopó при переме1-1инанин н течение 1 ч добавляют 15 мл 0,0125 М раствора гидроокиси кальция.

Смесь разделяют на центрифуге и твердую фракцию осторожйо дважды промывают эфиром (по 10 мл).

В колбу емкостью 250 мл с мешалкой заливают равные (по 50 мл) объемы эфира и 0,1%- ной соляной кислоты и вносят твердый осадок кальциевых солей.Систему выдерживают при перемеши. вании н течение 1ч.После расслоения эфирный раствор отделяют, высушивают

Я о

s течение 12 ч при температуре 0 С над безводным сульфатом натрия. Эфир затем удаляют вакуумным упариванием (20 мм рт.ст., 18 С) и растворяют осадок в 50 мл смеси бензол-этилацетат-метанол в отношении объемов б:4 1 и пропускают раствор через хроматографическую колонку (13Х5001 .силикаголь КСК .30-60 мкм). Колонку последовательно промывают 150.мл смеси бензол-этилацетат (3:2), 300 мл смеси бензол-этилацетат-метанол (30:20:l); 100 мл смеси бензол-этил- ацетат-метанол (3 2:1) и 50.мл такой же смеси (1:i:1}. получают 5 растворов 1-й — исходный растворитель, ЦНИИПИ .Заказ . 4764/5

Филиал ППП Патент

2-5 — злюаты. Из каждой фракции элюата отбир4ют пробу объемом 5 мл, растворитель из которой удаляют вакуумным упаринанием. Остаток пробы растворяют в 10 мл физиологического раствора. Биологическую активность фракций 1-5 определяют,кимографически по методике, разработанной на кафедре внутренних болезней

-ИТИММП (снимают кимограммы изолированных отрезков тонкого отдела кишечника кролика под воздействием физиологических растворов, содержащих выделенные фракции ПГ) °

10

Физиологической (биологической) активностью обладают фракции ПГ 3 и

4. Элюаты 3 и 4 объединяют и упаривают н вакууме при разрежении

20 мм рт.ст. и температуре 28 С. Получают 0,0197 r твердого остатка., который растворяют в 150 мл физиологического раствора. Указанный раствор биологически активной фракции может ,быть применен в данном виде.

40

Формула изобретения

Способ выделения биологически активной фракции из семенной жидкости животных, включающий ее экстракцию и последующую хроматографическую очистку и разделение, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения способа без снижения активности получаемой фракции, перед экстракцией к семенной жидкости добавляют этанол, декантируют водно -спиртовую смесь и подвергают ее обработке гидроокисью кальция, полученный осадок регенерируют кислотой при одновременном добавлении к нему эфира Для проведения экстракции активной фракции.

Источники информации, принятые

60 во внимание при экспертизе:

1.Хof В .оЕ.Сйет.,1963 .. т. 238, 910, с. 3 229-3 234 .

Тираж 703 Подписное г.Ужгород, ул.Проектная,4 для индентификации фракции пробу смесей 3 и 4 обрабатывают 0,1 н.раствором едкого натра и нагревают при

50 С в течение 30 мин. УФ-спектр поглощения фракции составляет

Л „,ц = 278 нм, что согласуется с данными, опубликованными в журнале J..of 31об.сЬеп., 241, . 92, 257, 1966.

Тонкослойная хроматография (хлороформ:диоксан:вода:уксусная кислота при соотношении 35:60:2:З,проявительметанол); юнода:серная кислота при соотношении 18:1:1, прогревание до

100 С):) „ и 3 равно, соответственно, 0,66 и 0,55 °