Реагент для обнаружения белка в моче

 

оhЦ кни е

И ЗО В РЕТЬ-Н И Я ю 633501

К ПАУЕИТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено05.03.76 (21) 2328363/28-13 (23) Приоритет — (32) 1-2 03 5 (31) P 25 10Я33.6 (331 ФРГ (43) Опубликовано 15.11.78.Бюллетень №42 (45) Дата опубликования описания ть.11.зз (51) М. Кл, 6 01 N 33/16

Государственный комитет

Совета Ниннстроа СССР по делам иэооретений и отнрытий (53) УДК616.63 (088.8) Иностранцы

Вальтер - итгерсдорф, Вернер Гюгляйн Вольфганг Вернер, Ханс-Георг Рей и Петер Рикманн (ФРГ) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма Берингер Маннхайм, ГмбХ" (ФРГ) (71) Заявитель (54) РЕАГЕНТ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ БЕЛКА В МОЧЕ

0,5 — 5

10 — 30

0,1 --- 1,0

Изобретение относится к диагностическим средствам и может быть использовано в диагностике почечных заболеваний.

Известен реагент для обнаружения белка в моче, состоящий из носителя, индикатора и буфера (1) .

Однако известный реагент вступает в реакцию как с белком, так и с побочными продуктами.

Целью изобретения является повышение специфичности реакции путем устранения взаимодействия реагента с побочными продуктами.

Эта цель дости гается тем, что реагент в качестве индикатора содержит октагалогенсульфофталеин дополнительно содержит полипропиленгликоль, а также смачиватель при следующем соотношении ингредиентов в r на 100 мл раствора:

Октагалогенсульф офталеин 0,02 — 0,2

Полнпропиленгли коль

Буфер

Смачиватель

В качестве. способного всасывать носителя применяют фильтровальную бумагу, но также может быть применен волокнистый прочес, асбест и подобные материалы. Полипропиленгликоли, которые используют для реагента, должны иметь молекулярный вес примерно от 500 до 10000, могут быть использованы линейные полипропиленгликоли, блокполимерные продукты, полученные из окиси пропилена и окиси этилена, а также разветвленные соединения, в которых

ip окись пропилена заполимеризована с такими многоатомными спиртами, как, например, триметилолпропан, глицерин или пентаэритрит, и которые в некоторых случаях модифицированы дополнительно окисью этилена.

В качестве индикатора используют октагалогенсульфофталеины, например октабромфенолсульфофталеин (тетрабромфеноловый синий), октахлорфенолсульфофталеин (тетрахлорфеноловый синий), а также смешанные галогенированные соединения, например

3,3" — 5,5" -тетрабромфенол-3,4.5,6-тетрахлорсульфофталеин. 3,3" — 5,5"-тетрахлорфенол-3,4,5,6-тетрабромсульфофталеин и

3,3 -дихлор-5,5"-дибромфенол-3,4,5,6-тетрахл орсульфофтал си н.

633501

Особенно предпочтительными являются индикаторы, которые содержат в положениях 3,3,5,5"четыре атома хлора, Реагент для обнаружения белка требует применения сильного буфера, который даже при погружении в содержащуюся в теле жидкость, имеющую другое значение рН, сохраняет постоянное значение рН. При применении сульфофталенновых индикаторов буфер устанавливают на значение рН, которое лежит несколько ниже области рН перехода индикатора и тогда индикатор мало окрашивается, По отношению к очень малым концентрациям белка лучшая чувствительность достигается тогда, когда значение рН буфера лежит в области перехода индикатора, рН должно быть от 2,5 до 4,5.

При более низких значениях рН в большинстве случаев происходит ослабление белковой реакции при большем усилении реакцнк с азотистыми основаниями и обычной мочей. Предпочтителькое значение рН. зависит от индикатора, а также от типа пропиленгликоля и прочих реагентов, при которых значение рН и количество буфера изменяют таким образом, чтобы индикатор после погружения в свободную от присутствия белка мочу имел еще чистую окраску.

В качестве буфера могут быть использованы смеси, состоящие кз лимонной, яблоч, Пропнленглкколь 0,5 — 5, Буфер l 0 — 30

Индикатор 0,02 — 0,2

Поверхностно-активное вспомогательное средство 0,0 — 1,0

В качестве растворителя для ингредиентов применяют смеси, состоящие из воды и низшего спирта, в которых они растворимы. Но можно также сначала осуществлять предварительную пропктку буфером из воды и после этого производить последующую пропитку остальными составными частями из органического раствора.

Готовый реагент может применяться известным способом, может быть приклеен к ручке или запечатан между синтетическим полимером и сеткой с мелкими отверстиями.

Пример 1. Фильтровальную бумагу (Шляйхер и Шюль 2316) последовательно пропитывают следующими двумя растворам и к s каждом случае производят сушку при 60 С.

Раствор 1. .Цимонная кислота, моиогидрат, г 20

Ам миак, 25%-ный водный раствор, мл Около 1О

Вода дистиллированная, м.л До 100

Раствор имеет значение рН 4,1

1 — 2

i5 — 20

0,05 — О, l

0,2 — 0,5

Раствор 2.

3,3",5,5 -тетрахлорфенол-3,4,5,6-тетрабромсульфофталеин (рН =

3,9), мг 50

4о . Полкпропиленгликоль со средиим молекулярным весом 1200 (Полигликоль П 1200 (R), r 2

Меткловый спирт, мл до 100

Реагект реагирует с нормальной мочой, принимая желтый цвет, а с содержащей альбумин мочой принимает окраску от зеленой до сине-зеленой с сильной интенсивностью.

Моча с содержанием хинина примерно

50 100 мг0 0 дает такую же зеленую окраску, что и моча с содержанием 5 мг 0. альбумина.

Реактивная бумага такого же состава, но без пропиленглнколя реагирует с кор55 мальной мочой, принимая зеленую окраску.

Зеленая окраска от 5 мг% альбумина с надежностью ке может быть отличека от этой отрицательной окраски. Поэтому сравнивают с реакцией 25 мг альбумина: уже прнной, винной кислот и других, а также. из их щелочных или аммокийных солей.

Для лучшего диспергирования добавляют поверхностно-акти вные вещества. Для этого могут быть применены неионогенные агенты смачивания, а именно этоксклированные спирты жирного ряда и фенолы с

1 — 4 оксиэтиленовымн группами.

Агенты смачивания аннокного типа усиливают реакцию с азотистыми основаниями, в то время как поверхностно-активкые вещества катионного типа вызывают сильно искаженную положительную реакцию индикатора в ТоМ случае, когда применяют не очень кислый буфер, который тормозит бел $ ковую реакцию. По этой причине эти поверхностно-активные вещества не пригодныы, Дополнительно можно также вводить агенты набухания кли загустители, которые

29 могут затруднять сход реагентов с носителя, такими агентами может быть гидрооксиэтилцеллюлоза и гкдроксипропклцеллюлоза.

Могут быть также добавлены в реагент ком плексообразователи, например сульфат м агния. щ Про пилекгликолн, а также остальные составные части применяют в следующих количествах, в расчете ка 100 мл пронитывающего раствора, г: предпочтительна

63350!

До 100

Около 16

0,6

Формула изобретения мерно 25 мг% хинина имитируют это количест о белка. случае обычного быстрого теста 2-5 мг о хинина уже имитируют присутствие 5 мг% альбумина.

Пример 2. Фильтровальную бумагу (Шляйхер и Шюль 2316) последовательно пропитывают следующими двумя растворами и производят сушку при 60 .С.

Раствор 1.

16

Лимонная кислота, моногидрат, г 20

Аммиак, 25%-ный водный раствор, мл Около 6

Вода дистиллированная, мл

l5 рН раствора устанавливают на значение 3,! .

Раствор 2 .3,3",5,5",3,4,5,6-0ктабромфеиолсул ьфофталеин (тетрабромфеноловый синий, рН =3,6), мг 50

Полипропиленгликоль, средний молекулярныи вес 2000, г 1 .25

Нонилфенол, этерифицирова нный 1 — 2 оксиэтиленовыми остатками, г 0,4

Метиловый спирт, мл До 100

Оба указанных раствора применяют также с половинным количеством растворителя и перед пропиткой производят их обьединение.

Реагент реагирует с нормальной мочой, принимая желтую окраску, и с содержащей альбумин мочой реагирует, принимая зеленую окраску высокой интенсивности.

Моча с содержанием хинина примерно

50 мг% дает такую же зеленую окраску, как и моча с 5 мг% альбумина. 40

Реагент такого же состава, но без пропиленгликоля реагирует с нормальной мочой, принимая слабую зеленую окраску.

Примерно 10 мг % хинина в случае этой реактивной бумаги имитирует 5 мг in альбумина.

Если вместо нонилфенола, этерифицированного 1 — 2 оксиэтиленовыми остатками, применяют 0,4 г кокосового спирта, этерифицнрованного 2 окснэтиленовыми остатка- 5О ми, нли 0,2 г трнбутилфенола, этерифицированного 4 оксиэтиленовыми остатками, то получают практически идентичный реагент.

Пример 3. Фнльтровальную бумагу (Шляйхер и Шюль 2316) сначала пропитывают 15%-ным водным раствором натрий- 5 дигидроцитрата (рН 3,5) и сушат при 60 С.

Последующую пропнтку производят раствором следующего состава, после чего каждый раз производят сушку при 60 C:

А. 3,3",5,5,3,4,5,6-0ктахлорфенолсульфофталени, мг 50

Пол ип ропиленглнколь, г 1

Метиловый спирт;, мл До !00

Свойства полученного реагента соответствуют свойствам реагента, полученного в примере l.

Б. 3,3"-Дибром-5, 5 -днхлорфенил-3,4,5,6-тетрахлорсульфофталеин, мг

Десмофен 7200 (R), г 1

Иетиловый спирт, мл До 100

Свойства полученного реагента соответствуют свойствам бумаги, полученной в примере 2.

С. 3,3,5,5 -Тетрабромфенол -3,4,5,6-тетрахлорсульфофталеин, м r 50

Десмофен 7200 (R}, г 1

Метиловый спирт, мл До 100

Свойства полученного реагента соответствуют свойствам бумаги, полученной в примере 2.

Пример 4. Фильтровальную бумагу (Шляйхер и Шюль 2316) пропитывают приведенными ниже двумя растворами и производят сушку прн 60 С.

Раствор l.

Чблочная кислота г 15 б н. р аст вор ги дроокиси натрия, мл

Гидроксиэтилцеллюлоза 1Натрозоль

250G (К)), г 2

Вода днстиллированая, мл До 100 рН раствора устанавливают на зн ачени и 3,5.

Раствор 2.

Тетрабромфеноловый синий, г

Полигликоль Р 1200 (R), г 3

Хлороформ До 100

Свойства полученного реагента соответствуют свойствам бумаги, полученной в примере 2.

Предла гаемый реагент обладает высокой чувствительностью Во отношению к белку, не вступая во взаимодействие с побоч-. ными продуктами., Реагент для обнаружения белка в моче, состоящий из носителя, индикатора и буфера, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности реакции путем устранения взаимодействия реагента с побочн ымн продуктами, в качестве и ндикатора

633501

Составитель С. Малютина

Реда кто р Т. Дев ят ко Техред О. Луговая Корректор М. немчик

Заказ 6426!50 Тира>к 1070 Подписное

IlHHHHH Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

I 13035, Москва, )K-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», r. Ужгород, ул. Проектная, 4 содержит октагалогенсульфофталеин, дополнительно содержит полипропиленгликоль, а также смачиватель, при следующем соотношении ингредиентов в г на 100 мл раствора:

Октагалогенсульфофталеин 0,02 — 0,2

Полипропиленгликоль 0,5 — 5

Буфер 10 — 30

Смачиватель 0,1 — 1,0

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Руководство по клиническим лабораторным исследованиям. Составлено

В. E. Предтеченским. «Медицина», 1964, с. 351.