Способ определения активности фосфофруктокиназы (к.ф.2.7.1.11) в сперме животных
О Il И С А Н И Е ()635424
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЪСТВУ
Союз Советских
Соииалистических
Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 27 12.76 (21) 2436600/30-15 с присоединением заявки №вЂ” (51)М.Кл. б 01 N 31ji14
Государственный комитет (23) Приоритет— (43) Опубликовано 30.11.78. Бюллетень ¹ 44 (45) Дата опубликования описания 30.11.78 по делам изобретений и открытий (53) УДК 543.866.
591.463.1 (088.8) (72) Автор изобретения Ю. Г. Курило (71) Зая|витель Полтавский научно-исследовательский институт свиноводства
В (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ "" ФОСФОФРУКТОКИНАЗЫ (К. Ф. 2.7.1.11) В СПЕРМЕ ЖИВОТНЫХ
Из обретен ие относится к способу оиределен ия а кти в ности ферментов IB биологическихх "пка н ях.
Известен способ опр еделення,активности фосфоф руостокин.азы в гомогенате печени IH:в cbllBQIpl011KB зсрови,,который основан на обр азоваиии фосфоприоз из ф руктозо-6фосфата в ари сутствии зкзогеннюй альдолазы:(1).
К иекуба ционной среде, состоящей из
160 мкл трис-HCI буфера (IpH 8,2),,10,5 мкл наприя метабисульфата, 20 мкг щр исталл ичеакой альдолазы, 5 мкл фруктозо-6 фосфата, 3 мкл адеиюзанщрифосфор|нюй IKIHcJIoты (АТФ), добавляют цеич;рифумт гомогенизированной ткани — О,2 мл, что соответствует 20 мг ткани. Конечный объем р еакционной смеси 1 мл.
После и н куба|щии и осаждении белков 20 в "пр ихлоруисусном фильтрате ошределяют фосфотриозы, по количеству которых судят об активности фосфофруктокин азы.
Недоста-пии известного способ.а заключаются в том, что он "пребует добавления 25 экзогамной альдолазы и д ает недостаточно тонные результаты, TBK KGK часть фосфотр иоз в инкубате изом@ризируетси триозофосфатизомеразой, что в едет к иоте ре фосфютриоз. 30
Цель изобретения — повызпение точности определения.
Для этого но н|редла,гаемому способу перед добавлением исследуемого материала в носят гиор аз инсульфат для иапибирова|ния тр иозофосфатизомеразы и хларистый магиий для а ктивирования реакции, 1и по содержа нию фосфотриоз или но убыли фруктозы в jpleBIKöèîííoé смеси судят об актинноопи фосфофруктокииазы.
Предложенный способ определения активиоспи фосфоф руктозсин азы основан на об разс,ва:нии фосфотриоз из фруктозо-6 фосфата без добавления экзоген нюй альдол азы с учетом того, что в с!перме естественно п роя|вляел ся высокая активность носледней. К роме того, в ивкубациоиную смесь вн осят активатор фосфофр уктсаппназы в IBIHде 0,1 N раствора хлористого м апния.
Предложенный способ более точен, потому что IB инкубационную смесь вносят гидразинсульфат,,который связывает фосфо приозы и тормозят триозофоафа пизоме разу, вызывая сдвиг равновесия ферментативной реакции в Ilmlpony расщепления ф|руктозо-1,6-дифосфата, а также обусловJIHEBBT образование триоз IB paBHIQIM количестве.
Способ осуществляется следующим образом.
635424 0,258 — 0,1244 л4г
1000 — Х
1000 - 1244
0,258
65
В (ннкубани<онную с(реду, состоящую из
0,5 мл 0,05 М (распво<ра трис-HCI бу(фера (рН 7,8), 0,25 мл 0,14 М (гидраэинсульф<ата, 0,25 мл 0,03 М <и<а тр(ий м ет<а би(сульфата, 0,25 мл О,ОЗ М .аденоз(и(нт(рифосфор(н(ой IKHCлоты н<априевой соли, 0,25 л4л 0,06М фруктозо-б-фосфата, в качестве активатора фосфюф(р<у(юпо(юнназы <в каждую (п(ро(би<р(ку,вносят 0,02 мл 0,1 М 0,75М <раство(ра N 1 мл 2,4-ди(нипр<офен<ил(пидра3(HIHIB <и вадогрев<ают 10 мин IHB (вод<я(и<ой <ба(не lrrlplH 38 С. Довод(ят объем (пр(обы 0,75 М Iplac пвор(ом NaOH до 8 мл (и кола(р(нм<епр(и(руют ir((pH 540 ммк (зеленый авета(фильпр на ФЭК<М. CTIaI6(HJrbH(a П<ри опсу(пспнии хим(и(чеаюи чистых $ B 1 мл пр(ихл<о<руксуаного ф(ильт<р(а<па оп(ределяют (колич(еспв<о щелочнола(билынoipo фосфара,по метод(у Ф(иске <и Суббороу в модиф(и(ка<ц(и(и Мо(рпинсон и <Виллак<о («Л<або(ратаp(Hое <дел<0», 19И, вып. 2). Ст(роят 1(р(аф<ичеакую (юр(и(вую, опкл<ндыва(я (на одной из ЮО(О(рд(ИНат ЮОдЕржа(НИЕ фОС<фара (МКг r»JL фильт(рапа), IHIB д<ру(пой — 9lKCITHIHIKIIIHIH. <П(р(и (расчете а(ктиан<о<ст(и уч(итывают, что 1 мкмоль ф<руктозо-1,6-д(ифо<сфата <ра(вен 22,4 Jttrlt = 2 rttr1LORSlrlt фосфотриоз = 2 rMALOrtSErlt rIrIeJIoRHoiJIiBI6IHJIblHoII фосфор(а ил(и 62 мкг щелоч(нолабилыно(по фосфора. (Полу(чен(ное кол(ичеспвю,щело<ч(н(ола(б(илын<0<по,фосфата в 1 мл фильпрата ум(н<ожают,н(а 8 и получают а(кпив<н(оcTb в 1 мл исследуемого матер(и<ала. AKTIHIBH<îoòb мож(ет <быть Bbr ra 10 crrep(MIHe(B, IHa,1 ммз массы Ic(rre(piMIHeH я на 100 ил <спермы. Например, IB 1 мл иссл<едуе<мо(г<о матер(и(ала (выявлено 0,(1244 мг щело<ч(н<олабильно(го ф<осфора. Ко(н(ценпра(ци<я апе<рм(иев в 1 мл, (по<д<сч(ита(нн(а(я (при (по(мощ<и (юамеры Г<0(ряева, 0,258 млрд. Выач(итыв<ают пю (пра(.-(<0(рции а(кт(и(нн(ость на 10 Icrreip(MIHPB: Если учесть, чтю,1 с(пе(рмий (нмеет объем 12i5 мк, л нолу(чен(ное кол(ичеатво обр,а<зова(вшего(ся щел<оч<н<ола(билыного фосфор а в 55 м(нюро<г(рам(мах (разделить на 125, то <получнм акпив<ноеть, (выр(ажен(н<ую (в IMIHK(po 482 ма<осы Iolreip(MIHCIH, т. (е. — — = 3,86 мкг/(мм 125 спер(м(иев, Если 1 мкмоль фру(ктоз<0-1,6-дифюсфапа аоопве-пспвует 62 мкг щелоч(нола3,86 мкг билынопо фосфа"па, то д<ел(нм = 0,062 мкмоля IHIB 1 мм IMaccbi опер<м(иев. (Полученные дaIHIHbre <об активности в 1 мл (и<с(следуемо<по (матеplHB;Ia у(м<н<ожаем н(а 100 IH (пол(уча ем а(кти<в(ность в 100 мл 0rr Ак"пи(в<ность (фосфоф(ру(юпоюиназы (в (anepIMå хряка мо(ж(н<о о(пределить по убыли ф(ру(к(позы в и(н(куба<нио(ни<ой амес(и. В 1 мл прихло(ру<ксусно<по <фильпрата добавляют 1,5 мл 0,05%(Hopo <распв<ора (резорпин<а (н(а 96 -IHIQIM зпил(оном сп:и(рте и 1,,5 мл 0,216М раствора железоаммонийнгх квасцов FeNH4i(S04) 2 (12Н О (в <ко(нцен приро<в<а(нн(ой сюл<янюй <юи<сло<те, хорошо <смеш(и<вают и (про(б(и(р(юи (контролыных <и о(пытных проб эа(к(ры(ваю(т,воз(душ(нььм<и хол<одHJIb(HIHIKIBIMH H ставят (на 40 мин irrlp(H 80 — 30 С (в (в<одя(ную ба<ню. Одн<о<в(р<еменн<о C Ta(BHT ста(идар-пные Ilr>piol6IHIpIKIH ic (из(вестной IKIQIH <Пригогпо(влен(ие ста(нднр пной (п<рюбы фруктозы: берут на(веаку (200 мг),ф(ру(кпозы,:высушен(ной <до постоя(н<н(о(го (веса IB сушиль(но(м (шк<а(фу при 7i5 — 80 С, и (распв(0<р(яют в 200 мл (колбе <в 0,1 М pa pacTiH iHH 50 мкг фруктозы. 0(нр(едел(яют коли<чеапв(о фруктозы вышеоп(иса(н(ны(м (р<езор(ц(ин(о(вым меподснм IB фильтр<апе и (в ста(н(да(рте. Фо"пометр,и<руют <пр,и 445 ил<и 480 л4мк, т. е. inip lII(poiIIoIpци<и .высч(и(ты(вают количеспвю фруктозы,в .и<с<следуем<ам материале, (получен(ное число у(м(ножают (на 8, т. е. <н<а <раз<ведение, iH IlIoJrvчают акпнвность B 1 мл <исследуемого <мате(р<иала. 3<атем, (как,аписа(но (вы(ше, делают (пЕреач<ет IHà 10 сперм(иев, IHB 1 люмз массы с(пермиев IH на 100 мл (исследуемого (м атер,иала. П<риме(нен(ие (пр<едложеч(ного способа поз<волк4т с большей поч(но<стью определять акти(нн<ость <фэсфoi(plp+KT 635424 Ф о (р м у л а (и з о б р е т е н и я Составитель A. Макаров Техред С. Антипенко Корректор И. Симкина Редактор Н. Хубларова Заказ 754/1163 Изд. № 710 Тираж 1080 Подписное НПО Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий Москва, 5К-35, Раушская наб., д. 4/5 Тип. Харьк. фил. пред. «Патент» Показатель а(ктявноспи (используется при оценке качества спермы при искусственном осемен(е(нии ж(и(во пных. Способ ю(п(ре(деле(ви я а(к(т(изности фосфофруктскин(азы (IK. ф. 2.7.(1. 11) (B сперме жи(вотных, (в(ключaIQIIJfHH доба(влееие и(сследуе(мю(по матереал(а (в (реа(кц(ионную омвсь и инкубирование смеси, отличающийся тем, что, с целью II01BbIIIIeHия точности опредеглен(ия,,перед доба(влен(ием (исследуе(мого мате(р(нала (внюсят глдразянсульфат для инпибирования триозофоофатизюме(разы и хлорпстый магний для активирования реак5 ци(и, и (пю содержа(н ию фосфотриюз или (пю убыли фруктозы IB реа(кц(ию(иной смеси судят об акт(ивноспи фюсфоф(рукто(еиназы. Источник (инфо(р(мацки, (принятый во 10 внлма(н(ие п(р(и экспертизе: 1. Lea M. A. and Walker D. С. — «Biochem. J.», 1965, 94, 665.
