Способ очистки трипсина

 

ОПИСАН HKl

ИЗОБРЕТЕНИЯ рц639866

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 10.05.77 (21) 2482876/23-04 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.12.78. Бюллетень № 48 (45) Дата опубликования описания 30.12.78 (51) М. Кл,з

С 07С 103/52//

А 61К 37/02

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 547.964.4.07 (088.8) (72) Авторы изобретения

Д. А. Сполите, Д. Я. Кукуранс и А. К. Арен (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ТРИПСИНА

Изобретение относится к улучшенному способу очистки трипсина, позволяющему получать препараты трипсина высокой степени чистоты.

В настоящее время для очистки препаратов трипсина широко используют аффинную хроматографию,(1), где очистка трипсина осуществляется сорбцией на афинных сорбентах, представляющих собой нерастворимую матрицу с присоединенным лигандом — веществом способным специфически и обратимо связываться с очищенным компонентом.

В качестве матрицы используют полимерные органические материалы, например целлюлозу, сефадекс, агарозу (2).

Наиболее близким к предлагаемому является способ очистки трипсина путем аффинной хроматографии,(3), где в качестве афинного матричного материала используют продукт взаимодействия амидина или гуанидина с нерастворимой матрицей, предварительно активированной обработкой цаногенбромидом, последовательной конденсацией с 1,6 диаминогексаном, затем с ангидридом янтарной кислоты. В качестве нерастворимой матрицы используют различные производные целлюлозы.

Раствор трипсина в трис-буфере пропусхают через афинный матричный материал, посторонние белки отмывают тем же буфером, для десорбции адсорбированного трипсина используют раствор хлористого калия в разбавленной соляной кислоте. Содержание трипсина в исходном препарате

65%, в очищенном — 95%, очищенный препарат не содержит химотрипсина.

Основной недостаток известного способа — недостаточная износостойкость приор меняемых матричных материалов, что приводит к потере афпнного матричного материала в процессе очистки и загрязнению выделяемого трипсина продуктами разрушения матричного материала.

15 Цель изобретения — повышение срока службы афинного матричного материала и увеличение эффективности очистки трипсина.

Поставленная цель достигается описываемым способом очистки трипсина с использованием афинной хроматографии, заключающимся в том, что в качестве нерастворимой матрицы используют пористые кремнеземные материалы, обработанные vампнопропилтриэтоксисиланом.

Предпочтительно по предлагаемому способу использовать в качестве пористого кремнеземного материала силикагель, 30 силохром, пористое стекло.

639866

15

Ско,.ость протекания в начале испытания, мл(ч

Скорость протекания после 30 дней работы, мл/ч

Вид афинной матрицы

Целлюлоза

Силохром

196

159

174

168

Кремнеземные материалы имеют сравнительно высокую механическую и химическую прочность, характеризуются отсутствием воздействия микроорганизмов в у словиях очистки фермента. Использование нерастворимой матрицы на базе кремнеземов не вызывает потерь афинного матричного материала и обеспечивает высокую чистоту препаратов трипсина. Введение промежуточной молекулы обработкой нерастворимой матрицы у-аминопропилтриэтоксисиланом обеспечивает стабильную связь лиганда с нерастворимой матрицей.

Пример 1. В хроматографическую колонку (9<15 см),помещают 3 г афинного матричного материала (N-сукциноил-3-аминобензамидин, присоединенный к силохрому, обработанному v-аминопропилтриэтоксисиланом) с содержанием 1×-сукциноил-3-аминобензамидина 72 мкм/г силохрома и уравновешивают пропусканием трисбуферного раствора (0,05 М; рН 8,0), содержащего 0,5 моль хлористого калия.

После уравновешивания через колонку пропускают 10 мл раствора смеси 62 мг коммерческих препаратов трипсина и химотрипсина, содержащего 20 мг химотрипсина и 42 мг трипсина в буферном растворе, использованном для уравновешивания колонки. После пропускания ферментных растворов, колонку отмывают от несорбированных белков тем же буферным раствором (полноту отмывки контролируют спектрофотометрнчески по снижению абсорбции раствора при 280 нм).

После отмывки сорбироваппый фермент десорбируют пропусканием 0,001 М раствора соляной кислоты с рН 3 0, содержащего 0,5 моль хлористого калия.

Выход трипсина 19 мг.

Содержание трипсина в исходном препарате 47ю/О

Примеси химотрипсина в десорбировапном препарате трипсина не обнаружены.

Содержание трипсина определяют методом титрования активных центров.

Содержание белка определяют методом

Лоури.

П р и м ер 2. В хроматографическую колонку (9X15 см) помещают 3 r афинного матричного материала (N-сукциноил-3аминобензамидин, присоединенный к силикагелю или пористому стеклу, обработанному у-аминопропилтриэтоксисиланом) с содержанием N-сукциноил-3-аминобензамидина 67 мкм/г силикагеля или 55 мкм/г по ристого стекла и уравновешивают пропусканием трис-буферного раствора (0,05 М; рН 8,0), содержащего 0,5 моль хлористого калия. Затем через колонку пропускают

10 мл раствора смеси 20 мг химотрипсина и

42 мг трипсина в буферном растворе, использованном для уравновешивания, колонки. После пропускания ферментных растворов колонку отмывают от несорбированных белков тем же буферным раствором (пол«оту отмывки контролируют спектрофотометрически по снижению адсорбции раствора при длине волны 280 нм). После отмывки сорбированный фермент десорбируют пропусканием 0,001 М раствора соляной кислоты с рН 3,0, содержащего 0,5 моль хлористого калия.

Выход трипсина 16 мг в случае силикагеля; 13 мг — в случае пористого стекла.

Содержание трипсина 96%.

Содержание трипсина в исходном препарате 57%.

Проведена сравнительная оценка скоростей протекания рабочих растворов через афинные матрицы из органических и неорганических материалов, что характеризует срок службы афинных сорбентов.

Результаты испытаний приведены в таблице.

Формула изобретения

1. Способ очистки трипсина, заключающийся в пропускании трипсинсодержащего раствора через афинный матричный материал, представляющий собой лиганд— производное амидина или гуанидина с нерастворимой матрицей, о т л и ч а,ю шийся тем, что, с целью увеличения срока службы афинного матричного материала и повышения эффективности очистки ферментного препарата, в качестве нерастворимой матрицы используют пористые кремнеземные материалы, обработанные у-аминопропилтриэтоксисиланом.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве пористого кремнеземного материала используют силикагель, силохром, пористое стекло.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Jany К, D., Ке11 W., Меуег Н., Kiltz Н. Н.

Preparation of à highly purified bovine trypsin for use in protein sequence analysis.

ВВА, 1976, 453 (1), 62.

2. Junowicz Е., Charm S. Е., «The derivativation of oxidized polysacharides for protein immobilization and affinity Chromatography», ВВА, 1976, 428 (1), 157.

3. Патент США № 3746622, кл. С 07G

7/02, 1971.