Способ получения 5 -цианэтиловых эфиров -защищенных дезоксирибоолигонуклеотидных блоков

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

«i>717063

+ Ю

// г °

17;-,. / 1"; / (51)М. Кл.

С 07 Н 19/18

С 07 Н 21/04//

A 61 К 29/00 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 130778 (21) 2644007/23-04 с присоединением заявки ) (о (23) Приоритет

Гос) дарственный комитет

СССР но делам изобретений н открытий (53) УД1(547 ° 963 ° .32.07(088.81

Опубликовано 2502.80. Бкзллетеиь ¹ 7

Дата опубликования описания 2502я0 (72) Автор изобретения

A.10. Мишарин

Институт молекулярной биологии ьН СССР (71 ) За яв итель (54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 5 -ЦИАНЭТИЛОВЫХ ЭФИРОВ м -ЗАЩИЩЕННЫХ ДЕЗОКСИРИБООЛЙГОНУКЛЕОТИДНЫХ

БЛОКОВ

Изобретение отяосится к усовершенствованному способу получения

5 -цианэтиловых эфиров N -защищен- . ных дезОксирибоо.:игонуклеотидных 5 блоков, являющихся промежуточными продуктами синтеза олигонуклеотидов, важного класса природных соединений, широко применяющихся в биологических исследованиях. 10

Известен способ получения 5-цианэтиловых эфиров N -защищенных олигонуклеотидов, заключающийся в конденсации 5 -цианэтиловых эфиров и -защищенных дезоксирибонуклеотидов с 3 -О-ацетильными производными

И -защищенных йуклеозид-5с-фосфатов, в присутствии мезитиленсульфохлорида или 2,4,6-триизопропилбензолсульфохлорида с последующим удалением 3 -О- защитной группы действием водной щелочи и .5 -цианэтилировании полученного N -защищенного динуклеотида в присутствии дициклогексилкарбодиимида (1).

Недостатками известного способа получения 5 -цианэтиловых эфиров защищенных дезоксирибоолигонуклеотидных блоков являются многостаднйность процесса, невозможность избирательного отщепления 3 -О-ацильной защитной группы в присутствии 5 -цианэтильной, проведение 5 -цианэтилирования в присутствии больших избытков дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) и гидракрилонитрила.

Целью изобретения является упрощение процесса.

Указанная цель достигается испОльзованием в качестве 3 -О-ацильных производных 3 -О-метоксиацетильных производных нуклеозид-5 -фосфатов и удалением 3 -О-защитной группы обработкой полунасыщенным раствором аммиака в абсолютном метаноле в течение 10-12 мин, что позволяет избирательно удалять только 3 -Озащитную группу и изъять из процесса стадию цианэтилирования динуклеотида, а также большое количество токсичных реагентов (ДЦК).

Способ получения 5 -цианэтиловых эфиров N -защищенных деэоксирибоолигонуклеотидных блоков, согласно изобретению, заключается в конденсации 5 -цианэтиловых эфиров

N -защищенных дезоксирибоолигонуклеотидов с 3 -О-метоксиацетильными

71706 производными и - защищенных нуклеозид-5 -фосфатов"с последующим удалением 3 -О-метоксиацетильной группы обработкой полунасыщенным раствором аммиака в абсолютном метаноле в течение 10-12 мин. Строеййе полученных соединений подтверждено данными хроматографического анализа, УФ-спектрами и методом ПМР.

П р н м е р 1. Получение 3 -О-меток сиа«цетйль йы«х йрой зв одйых - д«е з о«к синуклеозид-5 -фосфатов (6 à-r) 010 бИ ОСНВ

11(а-г) 0 — Р— 0- СН1 В

0Н

1(а-f) 0

II

Яб(от) 0- I — - 0- CHg 3 . з

0 е

3C(I,HI),0 — Р-О-(,Н З

0 + П

ОН

Пl (a-В) 1

0 Р— OCHI В

0К

lV (а-3) н

NC(CHg)

lit lV 9 i

0 P-0 — 0 В

I

g=- Р=о — СН В

-1

0Н

Пример 2. Получение 5 -цнанщ этилового эфира дезокситимидилнл-(3 -5 )-"дезокситимидина (1V а).

Смесь пирициниевых солей IIIa (0,% ммоля) и 1 а (1 миоль) высуши"вают упариванием с абсолютным пири65 дином; растворяют в 5 мл абсолютПиридиниевую соль 1 а-г (1 ммоль) высушивают упариванием с абсолютным пиридином, растворяют в 5 MJI абсолютного пиридина, добавляют 1 мл ме то«ксиу«к«сусного айгйдрида«, выдерживают 4 ч. при 20вС, добавляют 2 мл абсолйтного этанОла при 0©С и выдерживают 1 ч при О С. Ра«створйтель

" .удаляют в вакууме до сиропа, IIpo" мывают Зх10 мл абсолютного эфира, декантируя растворитель. Остаток выдерживают в 10 мл 50%-ного водноо

ro пиридина ) ч при 20 С, упаривают, цереупаривают 3 х 5 Йл вбды и пропускают через колонку с 5 см . смолк Дауэкс-50 (Lv ), элк4руя" водой.

3 4

В соединениях I и Ц а) В-тимин; б) В-М-6-бензоиладенин; в) В-8-4-бензоилцитозин

r) В-8-2-ацетилгуанин.

В соединениях ITI и Я а) B -В-тимин; б) В -В-N-6-бензоиладенин; в) В-Мб-бензоиладенин, В -N-4-бензоилцйтозин.

В соедИнении М:

В -В -тимин, В-8.-4-бензоилцитидин

Раствор =упарйвают,- переупаривают с абсалютПЙМ э 1"айолом"," затем с изопропаном; Остаток промывают 4х5 мл абсоЛЮТного" йзопропанола, продукт выделяют Фйльтрованием или центрифугированием" в виде литиевой соли, промывают абсолютным эфиром и сушат в вакууме. Выход соединений,%:

tI а 93;1Ч б 90;Ц в 92; йг 95.

717063

Формула изобретения

Составитель Л. Никулина

Корректор Г. Решетник

Редактор В. Минасбекова Техред М.Келемещ ж 495 Подписное

Заказ 9752/29 Тираж

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по " делам изобретений и открытий

4/5

113035, Москва, ж-35, Раущская наб., д- / оектная, 4 филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Про "

l ного пиридина, добавляют 3 ммоля мезитиленсульфохлорида, смесь концентрируют до объема 3 мл и перемешивают 3,5 ч при 20 С, затем охлаждают до 0 С и добавляют б мл

1М триэтиламмонийбикарбонатного буфера (рН 7, 5), выдерживают 14 ч при 4ОС, затем упаривают и переупаривают (Зл5 мл) d 50%-ным этанолом. Смесь растворяют в S мл полу-, насыщенного раствора КН в абсолютном метаноле, выдерживают 15 мин при 20ОС, упаривают, переупаривают с абсолютным этанолом, растворяют в воде, наносят на колонку (5 х 40см) с целлюлозой ДЕ-32 (НСО ) и хроматографируют в линейном градиенте

15 концентрации и Н НСО3 (0-0, 15 М;

9 л) . Продукт упаривают, rIepeyIlaривают с водой и лиофилиэуют.

Выход 52%.

Пример 3. Получение 5 -циан- 20 этилового эфира )(-б-бензоилдезоксиаденилил-(3 -5 )-hl-б-бензоилдезоксиаденоэина (1V б) . Смесь пиридиниевых солей Цб (0,5 ммоля) и )II б (1,0 ммоль) высушивают упариванием с абсолютным 5 пиридином, растворяют в 5 мл абсолютного пиридина, добавляют 3 ммоля

2,4,б-триизопропилбензолсульфохлорида, смесь концентрируют до объема

3 мл и перемешивают 4, 5 ч при 29 С %0

O затем охлаждают до -30 С, добавляют б мл 1 М раствора триэтиламина в абсолютном пиридине, выдерживают при охлаждении 1 ч, добавляют при

О С равный объем 1 М триэтиламмонийбикарбонатного буфера и оставляют на 14 ч при 4ОC. Водный раствор экстрагируют (4 х 50 мл) эфиром, упаривают, переупаривают (3 х 5 мл) с 50%-ным водным этанолом, затем (5 х 5 мл) с абсолютным этанолом, 40 растворяют в 5 мл полуиасыщенного раствора NH% в абсолютном метаноле, выдерживают 15 мин при

20©С, упаривают, переупаривают (3 х 5 мл) с абсолютным этанолом, 4 растворяют в воде и хроматографируют, как в примере 1. Выход 44%.

Пример .4. Получение 5 -циан- . этилового эфира К -4-бензоилдезок""èöèòèäèëèë-(3 -5 )-К-б-бензоилдезоксицитидина (ЪЧ в) .

Нуклеозидный компонент — lilв (0,5 ммоля), нуклеотидный компонент«В б (1,0 ммоль), конденсирующий реагент — 2,4,б-триизопропилбензолсульфохлорид (3,0 ммоля). Методика аналогична примеру 3. Выход 40%.

Пример 5. Получение 5 -циачэтилового эфира дезокситимидилилвЂ(3 -5 )-дезокситимидилил-(3 -5 )-к-4-бензоилдезоксицитидина ().

Нуклеозидный компонент — 1)(а (0,5 ммоля), нуклеотидный компонентllв (1,0 ммоль), конденсирующий реагент — мезитиленсульфохлорид (5,0 ммолей). Методика аналогична примеру 2. Выход 4.2%.

Способ получения 5 -цианэтиловых эфиров N -защищенных деэоксирибоолигонуклеотидных блоков путем конденсации 5 -цианэтиловых эфиров

)(-защищенных деэоксирибоолигонуклеотидов с 3 --О-ацильными прбизводными )(-защищенных нуклеоэид-5 -Фосфатов в присутствии мезитиленсульфохлорида или 2,4,б-триизопропилбензолсульфохлорида с последующим удалением 3 -O-защитной группы, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве 3 -О-ацильных производных используют метоксиацетильные производные H -защищенных нуклеозид-5 --фосфатов, а последующее удаление защитной 3 -O-метоксиацетильной группы осуществляют обработкой полунасыщенным раствором аммиака в абсолютном метаноле в течение

10-12 мин.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

l.ЛЧЕЪВ Н, @ о с(пц Н.Ь.%tubieS on Робч-, wUCBBOt10I46 О g У МОЮ.ЯЧОВ, 1972 .72 219-249 (прототип).