Способ определения гетерозисного эффекта у гибридов первого поколения

 

Союз Советски н

Сомналистическин

Рес ублмк

ОП И(;,„®;;

ИЗО (iii 719566

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву

t (22)Заявлено 08.09.78 (2!) 2677231/30-15 (51)M. Кл.

А 01 Н 1/04 с присоединением заявки М

1Ъсударстнннньб1 кнмнтет

СССР

° î ленам нзобретеннй н етнрытнй (23) Приоритет

Опубликовано 05 03 80 Бюллетень М 9 (53) УЛК 631.52 (088.8) Дата опубликования описания 05 03.80 л (72) Автори изобретения

Али-Заде Мирза и P. Т. Алиев (7!) Заявитель

М „Фы-* ь-к: (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕТЕРОЗИСНОГО

ЭФФЕКТА У ГИБРИДОВ ПЕРВОГО ПОКОЛЕНИЯ

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции сельскохозяйственных растений.

Известны способы определения гетерозисного эффекта у гибридов первого поколения, по ко. торым определяют содержание нуклеиновых

5 кислот, в частности дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), по величине которых судят о наличии гетерозисного эффекта fl) и (2).

Недоста ами таких способов являются необходимость закладки полевых опытов и дли10 тельность определения конечных результатов.

Целью изобретения является сокращение сроков определения наличия гетерозисиого эффекта и исключение закладки полевых опьпов.

35i

Цель достигается. тем, что содержание" ДНК определяют в колеоптилях трехдневных проростков и по увеличению ее количества в клетках гибридов по сравнению с их родителями судят о наличии гетероэисного эффекта.

Способ осуществляется следующим образом.

Семена гибридов и их родителей проращивают в питательном растворе Кнопа. У трехдневных проростков снимают колеоптили, в ко2 торых определяют содержание 3HK (в мг %) и число клеток, а полученные показатели ДНК пересчитывают на одну клетку.

Для определения содержания ДНК колеоптили в количестве 2 г (свежего веса) гомогеиизируют 10 мл холодного 95%-ного этанола, затем гомогенат переносят в центрифужные пробирки, добавляют еще 10 мл холодного

95%-ного этанола и центрифугируют. Центрифугат отбрасывают, Осадок промывают следукнцими реактивами по 20 мл каждого: 95%-ным этанолом — 1 раэ при комнатной температуре;

50%-ным этанолом, подкисленным ледяной уксусной кислотой до рН 4,5 — 2 раза при комнатной температуре; 0,2 н. НС104 — 2 раза на холоде; 95%-ным этанолом — 1 раз при комнатной температуре; абсолютным этанолом с эфиром (3:}), прокипяченным с обратным холодильником 3 мин — 2 раза; эфиром при ком натной температуре — 1 раз. далее осадок высушивают в вакуум — эксикаторе и взвешивают. Предварительно обработанный материал суспензируют 5 мл 0,3 н. раствора NaOH и инкубируют при 30 С в те5

10,1, 0,19 и где Š— опти еская плотность;

n — вес навески, мг; 30

0,19 — постоянный эмпирический выведенный коэффициент;

10,1 — постоянный коэффициент для ДНК, Число клеток определяют путем мацерации кусочка ткани хромовой кислотой с последующим подсчетом в капле взвеси числа клеток в счетной камере Фукса-Розенталя под микроскопом. Для каждого объекта подбирают концентрацию хромовой кислоты и время мацерации, поскольку превышение оптимальных для мацирации условий приводит к разрушению клеток. цля листьев пшеницы достаточно

10 o-ной хромовой кислоты в течение 18 ч.

Количество взятой хромовой кислоты зависит от количества мацерируемых кусочков. Для 4> мацерации одного колеоптиля достаточно 1 мл ее. Перед подсчетом следует тщательно потрясти содержимое пробирки, чтобы получилась равномерная взвесь клеток. Если она слишком густая, ее разводят водой. Удобно считать количество клеток в взвеси такой густоты, чтобы в поле зрения (в одном большом квадрате камеры) было 30-50 клеток.

Подсчет проводят в четырех больших квадратах, взятых по диагонали счетной камеры в верхней к нижней сетках, После этого камеру пфомьп ают, вьпйравт, заполнян1т и вновь подсчитывают в четырех больших квадратах в каждой сетке. Эта же операция повторяется

3 719566 чение 18 ч. Гидролизат центрифугируют и осадок промывают 5 мл 0,3 н. раствора NaOH.

Экстракт и промывной центрифугат соединяют и к ним приливают 0,3 н. раствор NaOH до

10 мл. Осадок отбрасывают. Соединенные экстракты подкисляют 15%-ной НС104 до рН 1, выдерживают 40 мин при 4 С и . центрифугируют. 11ентрифугат добавляют к фракции ДНК, Общий объем экстракта доводят, водой до

25 мл. 10

Осадок ДНК вЂ” протеин суспензируют 3 мл

0,5 н. раствора НС10; нагревают на бане до

70 С и выдерживают при этой температуре

15 мин. Затем охлаждают и центрифугируют при .2 С. Осадок протеина промывают 2 мл 15 холодного 0,5 н. раствора НС104 при 2 С, центрифугируют и промывной центрифутат соединяют с основным экстрактом. Общий объем экстракта доводят 0,5 н. раствором

НС104 до 5 мл. 20

Раствор ДНК замеряют на спектрофотометре против 0,5 н. раствора НС104. Затем проводят при длине волны 270 и 290 нм.

Расчет количества ДНК (в мг/мл) производят по формуле:

Ег1о — Ег9о

4 и в третий раз.. Таким образом, просчитываются по 24 квадрата из каждой пробирки, Полученные цифры по количеству клеток в одном большом квадрате пересчитывают на объем всей имеющейся в пробирке взвеси клеток и затем вычисляют число клеток во взятом отрезке.

Для каждой пробы получают 24 цифры с учетом биологических повторностей, что дает

72 измерения для каждого варианта. Полученные данные подвергают математической обработке ..

Установив число клеток на единицу свежего веса образца соответственными подсчетами показателей нуклеиновых кислот в мг % свежего ( веса, пересчитывают количество ДНК на одну клетку.

Полученные данные по содержанию ДНК в соматической клетке гибридов пшениц и их родителей приведены .а нижеследующей таблице.

Показатели, данные в графах 3 и 4 этой таблицы, характеризуют продуктивность одного растения и гетерозисный эффект у гибридов, Приведенные в таблице данные свидетельствуют об увеличении количества ДНК в соматической клетке проростков гетерозисных гибри. дов. При этом установлена прямая связь между уровнем гетерозисного эффекта и степенью увеличения ДНК в клетке. Так, например, гибрид Эритроспермум х Ферругинеум (Е,) по весу одного колоса и по весу зерна в одном колосе резко отличается от своих родителей.

У этого гибрида в соматической клетке содержится больше ДНК, чем в клетке родителей.

Гибрид Ферругинеум х Эритроспермум по продуктивности не резко отличается от родителей.

В соматической клетке этого гибрида количество ДНК увеличивается также не резко, Таким образом, в соматической клетке гетероэисного гибрида Гюргяна-1 х Эритролеукон, отличающегося высокой продуктивностью, содержится больше ДНК, чем в соматической клетке родительских форм, а у гибрида Эритрослермум х Элитролеукон при заметно низком гетерозисном эффекте количество ДНК в соматических клетках увеличивается слабо, Все это доказывает наличие связи между уровнем гетерозисного эффекта у гибридов и степенью увеличения количества ДНК в соматических клетках.

Использование предлагаемого способа определения гетерозисного эффекта у гибридов первого поколения по содержанию llHK в осмотических клетках проростков обеспечивает получение ожидаемого эффекта за очень короткое время, исчисляемое днями, отменяет необходимость в проведении-длительных полевых опытов, требующих месяцы, а иногда и годы. —, - ".Ф

° л ф ФЕ.

Составитель Л. Марченкова

Редактор В;Бородкин», Техред Н.Ковалева Корректор М. Демчик

Заказ 10094/3 Тираж 723 Подписное

ЯЙИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Фйлиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 г " Ф 7 :,::, ., ", 71956 г

Ф о р м у л а и з о б р ъ т е н- и я

Способ определенйя гетерозисйого эффекта у гибридов первого поколенагл тем "офеделе ййя удержания в" соматических клетках гибридов и их родителей дезоксирибонуклеиновой кислоты, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени определения наличия гетероэисйого эффекта и исключения закладки полевых опытов, содержание дезоксирибо- ц> нуклеййовой кислоты определяют в колеопгилях трехдневных проростков и по увеличению ее количества в клетках гибридов по сравнению с их родителями судят о наличии гетерозисного эффекта.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Али-Заде М. А,, Алиев Р; Т. Изменение содержания нуклеиновых кислот у гетерозисных гибридов пшеницы. Извеетие AH Азербайджанской CCP Серия биологических наук,.1973, Р 4.

2. Али-Заде М. А., Алиев Р. Т. Увеличение содержания ДНК в клетке гетерозисных гибридов пшенйцы. Доклады АН АзербайджанскойССР, 1973, М 29, !6 1 (прототип).