Способ количественного определения активности специфических эндонуклеаз-рестриктаз

 

ОПИСАН И

ИЗОБРЕТЕН И. сПЫЧЕСКАЯ

«ка МБД

< >7 824

Союз Советских Социаяистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ (61) Дополнительное к авт. сеид-ву (22) Заявлено 170877 (21) 2520258/28 с присоединением заявки ¹â€” (23) Приоритет

Опубликовано 1506.80. Бк>ллетеиь

Дата опубликования описания 15.06В (51)М. Кл.

С 12 D 13/10

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15.08 (088.8) (72) Авторы изобретения

Д.П.Вайткевичюс и Э-A.A. Янулайтис

Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (71) Заявитель (54 ) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЭНДОНУКЛЕАЭ-РЕСТРИКТАЭ

Изобретение относится к микробиологической промынленности, в частности, к производству ферментов, и представляет собой. новый способ количественной оценки ферментативной активности эндонуклеаз-рестрнктаз.

Известен способ количественного определения активн9сти специфической. эндонуклеазы-рестриктазы Есо Rl путем инкубации фермента с кольцевой меченой:. P дезоксирибонуклеиновой кислотой вируса SV-40 в среде, содержащей минеральные соли и органические вещества, при постоянных температуре и рН. После заветхаения 15 инкубации исходный субстракт и продукты реакции разделяют методом электрофореза а агарозном геле. Количество продуктов реакции измеряют радиоизотопными методами (1). 20

Недостатком способа является его трудоемкость, которая связана с применением электрофореза для отделения субстрата от продуктов реакции, а также с получением и последующим 25 использованием меченого Р радио52 активного субстрата, что требует сложной и дорогостоящей специальной аппаратуры. Кроме того, данный способом определяют активность только 30 единственной конкретной эндонуклеазы-рестриктазы, в данном случае

Eco RI.

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является способ количественного определения активности эндонуклеазы-рестриктазы Eco Rl, заключающийся в инкубации при постоянных температуре и рН фермента с кольцевой меченой Н дезоксирибонуклеиновой кислотой плазмиды Со11Е6 в буфере, содержащем дезокснрибонуклеазу rec ВС, минеральные соли и органические вещества.

После завершения инкубации непрореагировавший субстрат осаждают трихлор,уксусной кислотой и отделяют от продуктов реакции центрифугированием.

Количество продуктов реакции оценивают радиоизотопными методами (2).

Однако и этот способ количественного определения активности эндонуклеазы-рестриктазы Eco RI имеет существенные недостатки, связанные с применением радиоактивной плазмидной дезоксирибонуклеиновой кислоты, получение которой сопряжено со значительными трудностями, а последующее использование в работе требует специальной дорогостоящей аппаратуры и соблю40824

Оптическая плотность при 260 нм

0,211

0,207

0,220

О, 226

0,072

0,070

Т а б л и ц а 2

Контр

Есо 1

0,110

0 114 дения особых мер техники безопасности.

Помимо этого, также как и в предыдущем случае, рассматриваемый способ дает возможность определять активность только единственной эндонуклеазы-рестриктазы.

Целью изобретения является упрощение и унификация процесса определения ферментативной активности.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве субстрата используют линейную дезоксирибонуклеиновую кислоту, иммобилизованную на целлюлозе, а продукты реакции измеряют спектрофотометрически.

Суть способа заключается в следующем. Фермент инкубируют при посто- 15 янных температуре и рН с дезоксирибонуклеиновой кислотой, выделенной из клеток Е coIi С 600 по методу Санто и Миура и иммобилизованной на целлюлозе марки Ватман ЦФ-11, в присутст- Щ вии минеральных солей и органических веществ. Реакцию останавливают добавлением ЭДТА с одновременным охлаждением инкубационной смеси. Активность эндонуклеаэ-рестриктаз определяют количеством дезоксирибонуклеиновой кислоты, отделившейся от целлюлозы под воздействием фермента. Количество свободной дезоксирибонуклеиновой кислоты — продукта реакции, определяют измерением оптической плот-ЗО ности при 260 нм.

Разработанный способ позволяет определить активность любых эндонуклеазрестриктаз, так как фрагменты дезоксирибонуклеиновой кислоты отделяются от целлюлозы под воздействием любых ендонуклеаэ-рестриктаз. Другое отличие состоит в том, что при опреде.лении ферментативной активности предложенным способом не требуется спе- 40 циальных помещений и служб, необходимых при работе с радиоактивными су бстратами .

Пример 1. Определение активности эндонуклеаз-рестриктаэ Eco RI и ЕСО RII в очищенных препаратах.

1 г субстрата — иммобилизованной на целлюлозе дезоксирибонуклеиновой кислоты — суспендируют в 30 мл буферной смеси 1 (0,1 M трис-НСl-буфер, РН 7,5у 0,05 M NBCI; 0,01 M MgSO4 ), разливают по 1 мл в шесть центрифужных пробирок и добавлжот по 3 мл охлажденной до 4 С буферной смеси 1, содержащей дополнительно 0,05У, тритона

Х-100. Суспензию осторожно переме- 55 шивают при помощи стеклянной палочки и центрифугируют при 4 С 2 мин при

500 об/мин. После окончания центрифугирования насадочную жидкость сливают.

Центрифужные пробирки с субстратом помещают в ледяную баню. B две про бирки добавляют по 5 мкл очищенного препарата рестриктазы Eco RI в другие две — по 5 мкл очищенного препарата рестриктазы Eco RII, а в оставшиеся пробирки, служащие контрольными, фермента не добавляют. Содержимое пробирок осторожн о пе ремеливают стеклянной палочкой и помещают в термостат на 15 мин при 37 С.

После завершения инкубации пробирки помещают в ледяную баню и добавляют по 1 6 мл 2 мМ раствора трилона Б. Суспензию перемешивают и центрифугируют 5 мин при 3500 об/мин. Надосадочную жидкость переливают в кювету спектрофотометра СФ-16 и измеряют оптическую плотность при 260 нм пРотив 2мМ РаствоРа трилона Б. Результаты измерения приведены в табл ° 1.

Таблица l

За условную единицу активности принимают количество эндонуклеазырестриктазы, которое за 15 мин инкубации при 37 С дает в опытной пробе по сравнению с контрольной прирост поглощения при 260. нм на одну оптическую единицу.

Активность препарата эндонуклеазрестриктаэ рассчитывают из Разностей средних оптических плотностей опытных и контрольных проб и относят полученные результаты к 1 мл исследуемо| го преп ара та:

0 220+ 0 226

Есо ВХ

0 072 + 0 070 0 005

0 211+0 257

Есо 211

0 2 + 0 070 0 005

Пример 2. Определение активности рестриктаэ Eco Rl u Eco Rl l в неочищенных препаратах.

Ход определения ферментативной активности такой же, как в примере

1, единственное отличие состоит в том, что после добавления трилона Б в контрольные пробы вносят по 5 мкл соответствующих препаратов эндонуклеаз-рестриктаз. Результаты представлены в табл ° 2.

Оптическая плотность при 260 нм

0,223 0 191 0 354

0 219 О 187 0 358 740824

Формула изобретения

Составитель Н,Паников

Техред М.Кузьма Корре к тор В. БУ т яга

Редактор E.Õîpèíà

Заказ 3154/31

Тираж 5 22 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, X-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Активности препаратов ферментов рассчитывают аналогично тому, как это было сделано в примере 1, и получают следующие результаты: активность эндонуклеаэы-рестриктаэы Есо RI

21,8 Е/мл, активность эндонуклеазырестриктазы Eco RTI 33,4 Е/мл.

Предлагаемый способ позволяет, таким образом, количественно определить кактивность зндонуклеаз-рестрик таз в препаратах разной степени очистки. Для приготовления субстрата вместо дефицитной и дорогостоящей дезоксирибонуклеиновой кислоты, получаемой с исйользованием радиоактивных соединений и специальной сложной аппаратуры, применяют нерадиоактивную дезоксирибонуклеиновую кислоту, получаемую с,использованием дешевых реагентов и несложной аппаратуры.

Применение иммобилизованного на целлюлозе универсального субстрата поз- 20 воляет предлагаемым способом проводить определение активности не только эндонуклеаэы-рестриктазы Есо RI, но и любых других эндонуклеаз рестриктазного типа действия. 25

Простая аппаратура, дешевые реактивы, применяемые для количественного определения ферментативной активности, а также снижение трудоемкости позволи т (по предварительным расчетам) сэкономить около 4500 руб. в год при использовании предлагаемого способа . во ВНИИ прикладной энзимологии Главмикробиопрома СССР.

Способ количественного определения активности специфических эндонуклеаз-рестриктаз, предусматривающий введение препарата рестриктазы в буфер, содержащий минеральные соли, органические вещества и субстрат,инкубирование реакционной смеси, отделение продуктов реакции от субстрата и измерение их количества, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения и унификации процесса, в качестве субстрата используют линейную дезоксирибонуклеиновую кислоту, иммобилизованную на целлюлозе, а продукты реакции измеряют спектрофотометрически.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Р.I. Green, Methods of

MoIecuIar B1oIogy,1974,voI.7, р.87 °

2. P. Modrich, D.ZabeI, I.BioI

Chemistry, 1976, voI 251, р. 58665874 (прототип) .