Способ получения антибиотика
! КатЕ:- . « - -/= ти б,-,(„;и-> Ä е..а Ж5А
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
Союз Советскнк
Социалистических
Республик
<1н738517 (6) ) Дополнительный к патенту (51) И. Ыл. (22) Заявлено 31,0,3,78(21) 2596895/28-13
С 12 D 9/14 (23) Приоритет — (32) 31.03.77
Государственный комитет
СССР но делам изобретений и открытий (31) 35375/77 (33) Япония (53) УДК615. 779. . 931 (088. 8) Опубликовано 30,0580,Бюллетень № 20
Дата опубЛикования описания 05,06,80
Иностранцы
Казухико Окамура, Шой Хирата, Язуши Окумура, Язуо Фукагава, Язутака Шимаучи, Томоюки Ишикура, Кагеаки Коуно (япония) и Йосеф Лайнь (США) (72) Авторы изобретения
Иностранные фирмы Санраку-Оушн КО., ЛТД (Я он я) и Пзнлэбс, Инк (США) (71) Заявители (54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА
Из обрете ние относитс я к области микробиологии и касается получения антибиотиков, обладающих ингибирующим дейс тв ием.
Предложенный антибиотик новый и способ его получения в научно-техни- . ческой и патентной литературе не описан.
Целью изобретения является получение антибиотика общей формулы 10
5-СН С о (1) сн сн
Q GOOK„ где R — водород, металл, алкил или трифенилметил.
Достигается это тем, что штамм
Streptomyces A 271 выращивают в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, при рН 4,0-9,0 и
20- 40оС с последующим выделением целевого продукта в виде кислоты или в виде сложного эфира, или соли.
Штамм Streptomyces выделен из почвенного образца, собранного недалеко от храма Eiheiji в районе Voshida npeфектуры Fukui в Японии, обозначенный номером A 271.
Культура депонирована в Fermenta=
tion Research institute, Agency of
Jndustriai! Science and Technofogie, где она хранится под номером FERM — Р ,Р 3984 ° Образец организма Streptomyces
А 271 депонирован также институтом
АТСС под Р 31358.
Морфологические признаки. Развет-. вленность полученного мицелия простая, верхняя часть его образует крюки,петли или неполные спирали. Эти формы наблюдаются при культивировании на среде из овсяной муки и глицерин-аспарагиновой агаровой среде, в то вре мя как прямые или же изогнутые формы обычно образуются на среде из дрожжевого и солодового экстрактов.
Форма овальная или цилиндрическая, причем эти споры образуют цепь, состоящую более чем из 10 (обычно 10-50) спор. Размер 0,8-1,0 х 1; 0-1,8 мк, поверхность гладкая, не наблюдается ни жгутиков, ни спорангиев. На воздушном мицелии образуются гифы.
Культуральные признаки штамма
Streptomyces А 271 приведены в табл 1, 738817
Таблица
Цвет воздушного
Рост мицелия
Цвет мицелия-субстрата
Растворимый пигмент
Среда
Светло-оранжево-желтый
Светло-желтый светло-оранжевожелтый
Отсутствует
Бледно-оранжево-желтый до светло-оранжево-желтотого
Светло-желтый
Глюкозо-аспарагиновый агар
То же
То же
Бледно-оранжево-желтый до светло-оранжево-желтого
Светло-желтый до слегка желто-розового
Глицерино-аспарагиновый агар
Светло-ора нжево-желтый до светло-желтого
Б.чедн о- оранжев о-желтый до светло-оранжево-желтого
Агар на ос нов е крахмала и неорганической соли
Бледно-оранжево-желтый до светлз-оранжево-желтого почти не определенный
Св етло-оранжево-желтый до коричневато-желтого бледно-желтый
Тирозиновый агар
Бледно-оранжево-. желтый до светло— оранжево-желтого
Светло-ора нжев о-желтый до бледно-коричневого
Агар из дрожжевого и соло,цового экстракта
Бледно-ора нжевый до светло-оранжево-желтого
Светло-желтый
Агар из овсяной муки
Сахарозо-нитрат- Сильный ный агар
Физиологические характеристики.
Растет и развивается при 10 — 40 С, оптимальной является 20-30 С. Желати0 ну разжижает при 20 С; крахмал гидролизует, молоко пептонизирует, но не коагулирует.
Образует меланоидные пигменты на 40 пирозиновом агаре, на пептоновом дрожжевом железистом агаре и в бульоне ! из триптоно-дрожжевого экстракта. Хорошо усваивает арабинозу, ксилозу, глюкозу, рамнозу, плохо усваивает 45 сахарозу. Совсем не усваивает фруктозу, инозитол, раффинозу, маннитол.
Новый антибиотик получают путем инокулирования спор мицелия штамма
Streptomyces A 271 в аэробной питательной среде. В качестве питательной среды используют источники углерода, азота, неорганические соли.
В качеств е источников углерода берут . глюкозу, глицерин, мальтозу, сахарозу, мелассу, декстрин, крахмал, масляные или жировые источники углерода, такие как масло земляных орехов. При неОбходимости добавляют источники азота, пептон, мясной экстракт, муку из соевых бобов, масло из семян хлоп- 60 чатника, сушеные дрожжи, жидкость от замочки кукурузы, дрожжевой экстракт, казеин от снятого молока, нитрат натрия, нитрат аммония, сульфат аммония, неорганические соли; дика- 65 лийфосфат, хлористый натрий, карбонат кальция, сульфат магния, а также следы металлов, например кобальта, марганца.
Для предупреждения вспенивания во время ферментации добавляют антивспениватели, силиконовое и растительное масло..
Среду можно стерилизовать перед культивированием, рН доводят до 4-9, предпочтительно 6-8 до или после стерилизации.
Культивирование проводят в аэробных условиях.
Используют методы встряхивания в колбах или выращивание ведут в погруженном состоянии.
Температура ферментации колеблется от 20 до 400С, предпочтительно от
25 до 35С С . рН культурального бульона во время ферме нтации доводят до 4 — 9, предпочтительно б-8.
Ферментацию ведут до тех пор, пока не сконцентрируется достаточное количество антибиотика. Обычно ферментация длится от 30 до 90 ч, хотя этот период колеблется в зависимости от состава среды, температуры ферментации, штамма. Количество скопившегося антибиотика в Ферментационном бульне определяют биоиспытательным методом и биоавтографией.
/38517
Скопившийся антибиотик растворим в воде и находится в основном вне мицелия, поэтому мицелий удаляют после ферментации изв ест ными способами, фильтрацией, центрифугированием, экстракцией с последующим выделением антибиотика из фильтрата.
Для регенерации и.выделения антибиотика применяют экстрагирование при низком рн с применением растворителя, этилацетата, Н -бутанола или с обрат- О ной экстракцией из слоя растворителя в водный слой при более высоком рН, экстракции при нейтральном рН с применением растворителей; хлористого метилена, хлороформа или в присутствии липофильной четвертичной аммониевой соли, как бензалконийхлорид тетра-н-бутил-аммонийгидросульфат с обратной зкстракцией из слоя растворителя, содержащего йодистый натрий, йодистый калий. 20
Адсорбцию ведут на активированном угле или высокопористых стиролдивинилбензольных смолах, как амберлит и
- элюирование — водным метанолом, вод-. ным ацетоном, гель-фильтрацию — с
25 примеиением сефадекса, хроматографиюна колонне или тонкослойную хроматографию с применением целлюлозы, силикагеля, глинозема, а осаждение путем добавления растворителя — ацетона.
Антибиотик обладает широким спектром антибиотического действия, оказывая сильное действие против различных бактерий, например грам-положительных, таких как Staphylococcus, Dipl î- 35
coccus, Streptococcus, Sarcina, BaciEPus, и грам-отрицательных, относящихся к родам AEcaEigenes, Comamonas, Escherichia, K0ebsieH à, Proteus, Citrobacter, Entегоbacter, Serratia.
Антибиотик обладает свойством повышать антибиотическое действие других антибиотиков, таких как пенициллины и цефалоспорины, а также Citrobacter, frendii, Proteus иКgari s, Entего- ц
bacter aегоgenes, Serratia marcescens.
При введении мышам, зараженным патогенными грам-положительными бактериями, антибиотик оказывает значительное терапевтическое действие. 50
При введении мышам внутрибрюшинным путем в количестве 500 мг/кг антибиотик не оказывает смертельного действия у подопытных животных.
Так как антибиотик более устойчив .в виде соли, чем в виде свободной кис-5 лоты, то в фармацевтических целях его используют предпочтительно в виде соли.
В качестве солей антибиотика используют соли щелочных металлов (нат- 6l рия, калия, лития), щелочноземельных (кальция и магния), а также соли других металлов — алюминия, соль аммония, первичные, вторичные или третич-. ные амины (моноэтиламин, диметиламин, 65 триметиламин, моноэтаноламин, диэта» ноламин), соли с органическими основаниями, как бензатин, прокаин.
Пригодными солями для фармацевтических целей являются соли щелочных металлов, натрия, калия.
Антибиотик представляет собой одноосновную кислоту, содержащую карбоксильную группу в молекуле. Поэтому из антибиотика можно получить различные сложные эфиры с различными спиртами, меркаптанами или их производными; поступают при этом аналогично способу применяемому для известных антибиотиков на основе клавулановой кислоты или тиенамицина.
По изобретению соответствующим сложным эфиром антибиотика является сложный эфир общей структурной формулы сН -СН 3 — СН - СН -NH СО-СН . (II) ссор где R — низкая алкильная группа или трифенильная группа.
B приведенной структурной формуле (II) низшая алкильная группа обозна.чает группу с разветвленной или неразветвленной цепью, в частности алкильную группу с числом атомов С менее б, а именно группу с числом атомов С от 1 до 4. К ней относятся ме- тил, этил, н -пропил, изопропил, н -бутил, изо-бутил, н-пентил, изо-пен тил, н -гексил и др.
С оглас но из об рете нию сложные эфиры приведенной структурной формулы (ХХ) могут быть получены взаимодействием антибиотика структурной формулы (I).èëê его солей с соединенияМи общей структурной формулы (III) где R имеет то же значение, что и выше, а Y — атом или группа, которые можно расщепить.
Что касается атомов или групп, выражаемых символом Y в формуле (III), то применимыми являются, любой вид атомов или групп, которые поддаются расщеплению при контактировании с карбоксильной группой антибиотика„ например атомы галоидов, хлор, бром или йод, сульфонилоксигруппы, карбонилок"игруппы реакционноспособного характера, как -О-СО-CF> и т. и. Предпочтительными являются атомы галоида. .Примерами соединения приведенной структурной формулы (III) являются: метиловый спирт, йодистый метил, диметилсульфат, метилмеркаптан, этанол, бромистый этил, йодистый этил, этилмеркаптан, н -пропилхлорид,. н -пропилйодид, пропиловый спирт,изо-пропиловый спирт,изо-пропилбромид,н -бутиловый спирт, н -бутилбромид; н -бутилйодид, и -пентиловый спирт, н -пентил-1
738517 хлорид, Н -пент. лбромид, Н -пентилйодид, H -гексиловый спирт, н -гексилбромид, H -гe:<ñèëéoäèä, тритиловый спирт, тритилмеркаптан, тритилхлорид, тритилбромид и T. u.
Одним из примеров низших диазоал- 5 канов, пригодных для получения сложных зфиров антибиотика является диазсметан.
Взаимодействие антибиотика с соединениями общей структурной формулы (III) или с низшими диазоалканами мо жет быть осуществлено известными спо собами, применяемыми при этерификации в сложный эфир. Так, например, взаимодействие антибиотика с соедине- 15 ниями общей структурной формулы (III) или с низшими диазоалканами предпочтительно осуществляют в инертной жидкой среце, хотя его можно вести и без нее. B качестве такой среды можно применять углеводороды, как бензол, толуол, )l-гексан, циклогексан и галогензамещенные углеводороды„ как хлороформ, хлористый метилен или другие амиды, как диметилформамид, гексаметилфосфортриамид или другие;,диметилсульфоксид, эфиры, как диэтиловый, диизопропиловый, ди-и-бутиловый, тетрагидрофуран, диоксан или другие, сложные эфиры, как этилацетат, Н -бутилацетат или другие, кетоны, как ацетон, ЗО метилэтилкетон или т. п. Эти растворители можно использовать в отдельности или в виде смесей двух или нескольких из них .
Температура реакции может колебать-35 ся в пределах диапазона в зависимости от рода соединений общей структурной формулы (III), вида низшего диазоалкана рода жидкой среды или использу-! емых продуктов . Температуру реакции QQ можно выбирать в диапазоне, в котором антибиотик не разлагается заметно, однако предпочтительно применяют тем/
С> пературу порядка ниже 60 С, предпоч-.ительно, Π— 40 С, более предпочтитель-45 но, между 5 С и комнатной температурой. При осуществлении этой реакции можно добавлять стимулирующий реакцию реагент, как триметиламин, триэтиламин, пиридин, дициклогексилкар бодиимид, или др. В этих условиях реакция может быть завершена за 1-?4 ч, обычно 3-12 ч.
Согласно предпочтительному варианту изобретения антибиотик, применяемы11 для взаимодействия с реакционноспособным производным структурной формулы III, где R — трифенилметил,, не обязательно должен представлять собой выделенный очищенный продукт. Для реакции может найти применение . куль-40 тивированный продукт или профильтрованный бульон после удаления мицелия из культивированного продукта и сырой препарат антибиотика, частично очищенный регенерацией и выделением 65
К частично очищенным препаратам относятся, например, концентрированный элюат из активиров ан ного угля, которым обрабатывают профильтрованный бульон; концентрированный элюат из стиролдивинилбензольной смолы, как Diaion HP-20, которым обработан профилирова нный бульон, обессоленный концентрат с активированным углем элюата, полученного ступенчатой концентрацией хлористого натрия в фосфатном буфере из ионообменной смолы, например QAE — Sephadex, на котором адсорбирован концентрированный элюат из Diaion НР-20, концентрированный метиленхлоридный экстракт в присутствии бензалконийхлорида, концентрированный экстракт с хлороформом в присутствии crown-соединений; концентрированный бутаноловый экстракт при низком рН (3,5) и низкой температуре.
Полученный таким образом антибиотик-тритиловый сложный эфир выделяют из реакционной смеси и очищают рядом известных способов . По окончании реакции реакционную смесь вначале выливают в водную среду для удаления водных примесей, как побочные продукты и т. д. Предпочтительно в качестве водной среды применяют нейтраль ный буфер, чтобы значение рН приближалось к нейтральному. Антибиотик— тритиловый сложный эфир, экстрагируют малополярным органическим растворителем, в ocHoBHQM не смешивающимся с водой, как этилацетат, бензол, хлороформ и т. п . В течение ступени экстрагирования в целях его улучшения можно добавлять соль: хлористый натрий, сульфат аммония или т, п, По высушивании органического экстракта безводным сульфатом натрия тритиловый сложный эфир выделяют из растворителя известными методами, например гель-фильтрацией с применением продуктов как Bio †Bea S — X3, Sephadex LH-20 или адсорбционной хро. матографией с применением носителей, как силикагель, глинозем, фуллерова земля.
Тритиловый сложный эфир далее очи щают кристаллизацией из растворителя или смеси растворителей, как бензол, толуол, ксилол, этилацетат, диэтиловый эфир, хлористый метилен, хлороформ, гексан, петролейный эфир (кипящий в диапазоне
30-б0 С) .
Среди сложных эфиров общей структурной формулы (III), которые можно пОлучить вышеприведенными способами, антибиотик тритиловы сложный эфир—
738517
10 (П-а) СОΠ— С структурной формулы (П-а) . Н,— CHг 3 — снг- сн -Na- со — снг является одним иэ наиболее полезный, так как он более устойчин по сравнению с антибиотиком структурной формулы (I), его легче выделить, причем он сохраняет сильное антибиотическое действие и ингибирующее р-ëàêòàìàçó действие, в то время как тритиловый 15 сложный эфир известных пенициллинов не оказывает какого-либо ощутимого антибиотического действия. Далее, этот тритиловый сложный эфир структурной формулы (ll-а) очень важен в () качестве одного из активных сложных эфиров и полезного промежуточного продукта для синтезирования других фармацевтических полезных продуктов, поскольку тритиловую группу легко отщепить.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АНТИБИОТИКА,ТРИТИЛОВОГО СЛОЖНОГО ЭФИРА
Тритиловый сложный эфир антибиотика обладает широким спектром антибиотического действия, в частности против ряда различных грам-положительных бактерий родов Dipfococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Sarcina, BaciCEus и тому подобных органиэмов, а также грам-отрицательных бактерий родов ARcaBigenes, Comamonas и т. п.
Тритиловый сложный эфир антибиотика также оказывает хорошее. действие 4О против грам-отрицательных бактерий родов Escherichia, KgebsieGBa, Pro—
t.eus.
Существенной отличительной чертой тритилового сложного эфира антибиоти-45 ка является сильное действие против грам-отрицатель ных бактерий, устойчивых против антибиотиков, обладающих
P-лактамовой кольцевой структурой и относящихся к родам Citrobacter, 5О
Proteus, Enter obacter, К Kebsie 6 B a, Serratia.
Тритиловый сложный эфир антибиотика также обладает свойстном повы.шать антибиотическое действие. других у антибиотиков, н частности р-лактамоных антибиотиков, как пенициллинов и цефалоспоринов, против образующих
Д-лактамазу бектерий, как Citrobacter
f(eundii, proteus часgaris, Entего- . 6О
bacter aегоgenes., Serratia marcescens.
Тритиловый сложный .эфир антибиотика при введении мышам, зараженным патогенными грам-положительными бактери ями, оказывает значительное терапевтическое действие.
Тритиловый сложный эфир при введении внутрибрюшинньм путем мышам в количестве 500 мг/кг не вызывает смеРти подопытных животных.
Антибиотик и его производные, в частности тритиловый сложный эфир, оказывают в пробирке и на живом органиэме действие на грам-отрицательные и грам-положительные микроорганизмы и вследствие этого полезны при борьбе с бактериальными инфекциями и их предупреждении в организмах подопытных животных.
Антибиотик или его тритиловый сложный эфир и соответствующие составы могут быть введены орально, местно или парентерально (внутриненно, внутримышечно, ннутрибрюшинно и т. д.) и могут найти применение в целом ряде различньж фармацентических препа ратов в зависимости .от способа введе ния. Так, например, антибиотик или его тритиловый сложный эфир можно сочетать с фармакологически совмести,мым носителем, раэбавителем н твердом ниде (например B виде таблеток, кап, сул, порошков, гранул, покрытых сахаром таблеток, лепешек, порошков для распыления, суппозиториев и т. д.), в полутвердом виде (например в виде мазей, кремов, полутвердых капсул и, так далее), в жидком виде (например, в виде жидких растворов, эмульсий, вэнесей, лосьонов, сиропов, растворов для инъецирования, жидких растворов ,цля распыления и т. д.) .
Ециничная доза, содержащая антибиотик, или его тритиловый сложный эфир, может содержать 0,1-99% по весу актив ного компонента в любом ниде; жидком, полужидком и твердом.
Таблетки и капсулы для орального. введения могут быть получены в виде единичных доз и содержать связывающие агенты, например сироп, аравийскую камедь, желатину, сорбитол, трига— кант, полининилпирролидон, или наполнители, например лактозу, сахарозу,. крахмал, фосфат кальция, сорбитол, глицин или смазывающие агенты, например стеарат магния, полиэтиленгликоль, тальк, кремнезем или другие; агенты распада, например картофельный крахмалг смачивающие агенты — лаурилсульфат натрия или др. Таблетки могут быть покрыты в соответствии с общеизвестными методами. жидкие препараты могут быть получены для орального введения в виде масляных или водных суспенэий, растнорон, эмульсий, сиропов и так далее, или же их можно изготавливать в виде сухих проДуктов, которые разбавляют водой или другими соответствующими носителями перед внедением. Вышеприведенные жидкие препараты для орального введения могут содержать следующие фармацевтически совместимые
738517
В случае использования антибиоти= ка и/или его тритилового сложного эфира для лечения инфекций в организме свиней, коров, овец, кур препаратЫ могут быть получены в виде средств, расположенных внутри молочной железы на основе веществ замедленного или скорого действия, например н виде концентратов для добавления в корм., Фармацевтические составы согласно изобретению могут содержать антибио>ик или его тритиловый сложный эфир
60 ингредиенты; суспендирующие ингредиенты (например, метилцеллюлозу, сорбитоловый сироп, сахарный сироп, оксиэтилцеллюлозу, желатину, карбсксиметилцеллюлозу, гель стеарата алюминия, гидрогенированные съедобные жиры и масла), ненодные носители (например, этиловый спирт, пропиленгликоль, маслянистые сложные эфиры, фракционированное масло кокосового ореха, миндальное масло); эмульгирующие агенты (например, лецитин íà основе аравийской камеди, сорбитановый моноолеат); консервирующие средства (например, метил-п-оксибензоат, пропил-П-оксибензоат, сорбиновую кислоту) .
Суппозитории могут содержать обычные or.новные продукты для этих средств, как масло какао и различные глицериды.
Инъекционные составы могут быть получены в виде единичных доз в ампу- 20 лax или многодозовых емкостях с содер>ка н ием к о нс ерв ирующег о с редс тв а . Они могут иметь форму суспензий, раство ров и эмульсий в маслянистых или водных носителях, а в соответствующем 25 случае могут содержать суспендирующие или диспергирующие агенты и стабилизаторы. Антибиотик может быть получен в виде порошка, который можно комбинировать с непирогенной стериль- 3() ной водой перед применением.
Cocтавы, содержащие антибиотик или его тритиловый сложный эфир, могут быть получены в различных формах, пригодных для адсорбции через слизис- З5 тую оболочку носа, горла, а также бронхов. Так, например, для этой цели предпочтительными являются порошки или жидкие растворы для распыления, ингаляционные препараты, лепешки, полоскания для горла и так далее.
Для лечения глаз и ушей антибиотик изготавливают в виде отдельных капсул ,-.,ля ввода по каплям н жидком или полужидком виде. Для местного применения пригодны препараты на гидрофобной или гидрофильной основах, как порошки, лосьоны, кремы, мази.
Составы могут содержать ингреди-, енты, например, консервирующие, противоокислительные, смазывающие, при- 50 дающие вязкость, ароматизирующие, суспендирующие, связующие, стабилизующие продукты. в виде единственного активного ингредиента или же в сочетании с иными терапевтически действенными ингредиентами.
Так как антибиотик и его тритиловый сложный эфир обладают синергистическим действием на различных образующих Р -лактамазу бактерий в сочетании c P> -лактамовыми соединениями, их целесообразно комбинировать в фармацевтических составах с р -лактамовыми соединениями. В качестве подходящего р -лактамавого соединения используют бензилпенициллин, феноксипенициллин, карбенициллин, ампициллин и амоксициллин; а также производные цефалоспорина, как цефалоридин, цефалотин, цефазолин, цефалексин, цефокситин, цефацетрил, цефамондол, цефапирин, цефрадин и цефалоглицин.
Применяют антибиотик и известные
PJ лактамоные соединения в соотношениях от 20:1 до 1:150, предпочтительно, от 10:1 до 1:100.
При лечении бактериальных инфекций у млекопитающих количество антибиотика его тритилового сложного эфира можно изменять н зависимости от объекта лечения, веса тела, типа, серьезности и симптомов инфекции, способа и количества введений. При обыкновенном оральном или парентеральном введении целесообразной является суточная доза 0,05-500 мг/кг, предпочтительно
0,5 †2 мг/кг, более предпочтительно в виде частичных доз. Дозы нне приведенного диапазона также могут быть применены в зависимости от индивидуальных условий подвергаемого лечению организма.
Антибиотик или его тритиловый сложный эфир может найти применение не только в фармацевтическихсоставах, а также может быть добавлен в виде концентрата или же непосредственно в корм. Дополнительно его можно использонать в качестве активного ингредиента для консервирования кормов или их дезинфекции.
Во всех примерах качественные и количественные опыты на противомикробное действие основаны на следующей методике.
Биоиспытание на противомикробное действ ие .
Полученную за ночь куль туру
Cornainonas сerrigena В-996 на косом питательном агаре взвешивают в питательном бульоне с целью достижения оптической плотности клеток порядка
0,040 при 610 нм.
Пссевную взвесь добавляют в количестве 1% в расплавленную агаровую среду, ссдержащую 0,8% питательного бульонного порошка (Kyokuto Nutrient
Broth Powder) и 1% Bacto — Agar. 7 мл засеянной расплавленной агаровой среды распределяют в чашке Петри
14
13
738517 диаметром 9 см и дают отвердеть. По лучают пластину типа Comamonas.
Организм Staphy(, ococcus aureus
FDA 209 P культивируют за ночь в питательном бульоне со встряхиванием, разбавляя 50 раэ питательным бульоном для получения посевной взвеси, 1% по объему этой взвеси тщательно смешивают с расплавленной агаровой средой, содержащей 1Ъ Kyokuto Nutrient
Broth Powder и 1% Bacto-Agar 7 мл, каждой иэ засеянной расплавленной агаровой среды вливают с гелеобразованием в.чашку Петри диаметром 9 см.
Эту пластину обозначают биопластиной типа Staphyg ococcus.
Аналогично получают биопластину типа Afcaligenes. Полученную эа ночь питательную культуру на косом агаре организма A(ca(!igenes faecafis В-326 взвешивают в питательном бульоне, получая суспенэию из семян, концент- 2() рацию клеток которой доводят до оптической плотности 0,020 при 610 нм.
Агаровую среду, состоящую из 0,5% .Kyokuto Nutrient Broth Powder и 1Ъ
Bacto Agar, расплавляют при допустимой температуре и засевают 1,0% прививочного материала посевной суспензии. 7 мл засеянной расплавленной агаровой среды распределяют в чашке Петри диаметром 9 см и дают образоваться гелю. Эту пластину называют биопластиной типа ACca(.igenes.
Пульповый кружок (8 мм) -обычным способом пропитывают раствором испытуемого образца, выдерживают на чистом листе фильтровальной бумаги в течение времени, достаточного для удаления избыточного раствора и затем переносят на биоиспытательную пластину. После инкубации при 35 С в течение 20 ч эамерякт диаметр образовавшейся зоны ингибирования и сравнивают со стандартными растворами цефалоридина. Антимикробное действие антибиотика и родственных соединений выражают в виде единиц цефалоридинового эквивалента на мл.
В частности, раствор антибиотика и родственных соединений согласно изОбретению, показывающий тот же диаметр зоны ингибирования, как 100 мг/мхБО .цефалоридина, выражают, как 100 цефа.лоридиновых единиц/мл. Аналогично, если твердый образец антибиотика и родственных соединений согласно изобретению дает при концентрации 1 мг/мл 55 тот же диаметр„ как 1 мг/мл цефалори- дина, специфическая активность твердого образца будет выражена, как 1 цефалоридиновая единица на мг. Стандартная кривая биологического опыта немно-6О
1 го изменяется в зависимости от рода испытуемого организма. Для обозначения подопытных микроорганизмов применящт следующие названия — сокращения:
Comamonas цефалоридиновая единица (CCV), Staphylococcus — цефалоридино2.0
1,0
0,1
0,00013 вая единица (SCV); A(,ca(.igenes — цефалоридиновая единица (ACV) .
Биоавтография. Изготавливают большую биоиспытательную пластину за исключением того, что 100 мл засеянной расплавленной агаровой среды вливают в прямоугольную чашку 32 х 24 СМ, а не в чашку Петри (9 см) .
Подлежащую биоиспытанию бумажную хроматограмму помещают на 15 мин на зту большую испытательную пластину.
По удалении бумаги испытательную пласо тину инкубируют 20 ч при 35 С в целях обнаружения зон ингибирования. Эта техника позволяет не только вычитывать значение (я) Rf (качественное испытание), то также и определить антимикробное действие, основываясь на размерах зоны ингибирования.
В случае применения пластины для тонкослойной хроматографии между ней
1 и поверхностью испытательной пластины помещают тонкую бумагу. Аналогичный способ применяют для качественного и полуколичественного биологических испытаний.
Пример 1. Колбу Эрленмайера емкостью 500 мл, содержащую посевную культуральную среду, стерилизуют при
120 С в течение 15 мин. К богатой спорами косой культуре организма Streptornvces А 271 добавляют 10 мл 0,023
tween-80, после чего смесь слегка перемешивают, получая суспензию спор.
Колбу Эрленмайера емкостью 500 мл инокулируют 1 мл споровой суспенэии, встряхивая затем в целях культивирования 48 ч при 28 С на ротационном вибраторе. Затем 2 мл посевной культуры инокулируют в каждую из 6 колб Эрленмайера, из которых каждая содержит
100 мл описанной среды, после чего 4896 ч культивируют, встряхивая при
28 С на ротационном вибраторе.
Среда посевной культуры, вес.оо
Мясной экстракт 0,3
Bacto- гур опе 0,5
Глюкоза 0,1
Крахмал растворимый 2,4
Дрожжевой экстракт 0.,5
Карбонат кальция 0,4
Обезжиренная соевая мука 0,5 рН перед стерилизацией 7;5; после стерилизации 7,1; через 2 дня ферментации — 7,4.
Производственная среда, вес.Ъ
Среда AG-1
1 люкоза 1,5
Крахмал кукурузный 2,5
Жидкость от. замочки кукурузы
Сухие дрожжи
Метионин
СоСО - 6Н О рН перед стерилизацией 7,2," после стерилизации — 6,1; через 4 дня ферментации — 7,8.
738517
ACU/m
Medium
105
420
AG-1
AGA-2
AGB-1
420
340
105
0 9
185
AGB-41
ML-19
AG0-1
8,9
440
3,0
1,0
122
1,4
0 9
340
0,0001
6,5; после сте4 дня фермента20
5,0
1,0
0,3
2,5
0.,5
0,05
0,05
0,3
0,00013 ,Оу после сте- 0 дня ферментаТаблица 3
1, 000
500
500
50
50
50
50
150
270
850
870
10
300
270
12
230
13
200
50
170
125
Среда, АСА-2 вес. Ъ;
Глюкоза
Ц
Крахмал картофельный 2,5
Жидкость от замочки кукурузы 2,0
С ух и е дрожжи 1,0
СоСВ ° 6Н О 0,00013 рН перед стерилизацией 6,5; после стерилизации — 5,8; через 4 дня ферментации 7,8.
Среда AGB — 1, вес.Ъ
Мальтоза
Сухие дрожжи
Жидкость от замочки кукурузы
СосЪ . 6Н О рН перед стерилизацией рилизации — 5,9; через ции 7,9.
Среда AGB-41, вес . Ъ
Мальто за
Крахмал картофельный
Глицерин
Дрожжи сухие
Хлористый натрий
К2НРО„
MgSO4 7Н О
СаСО>
Сосб 6Н О рН перед стерилизацией 7 рилизации — 6,9; через 4 ии 7, 9.
Среда ML-19, вес.Ъ
Глицерин 4.,0 35
Пептон 0,5
Глюкоза 0,2
Крахмал картофельный 0,2
Соевая мука обезжиренна я 0„5 40
Др ожжи с оевые 0,5
Хлористый натрий 0,5
Сасо 0,2 рН перед стерилизацией 6,4; после стерилизации — 7,0; после 4 дней фермен- 45 тации — 7,0. . Среда AG0-1, вес. Ъ
Соевое масло 3,0
Дрожжи сухие 2,0
Хлористый натрий 0,5
К2 НР04 0,05
MgSO4 - 7Н20 0,05
СаСО 0,3
СоСЕ бН О 0,00013
2 рН перед стерилизацией 7,0; после стерилизации — 7,2; через 4 дня ферментацин -- 7,1.
Антибиологическое действие бульонного фильтрата определяют испытанием с применением пластин и организмов Соmamonas terrigena В-996, StaphyCococ- 60
cu s aureus 20 9Р, А(са Гigenes f aec а 0is
B-32б, Результаты, полученные через 72 ч после инокулирования, приведены в табл. 2.
Т à 6 л и ц а 2
Антибиологическое действие
Пример 2. Получение концентрированного элюата антибиотика РЯ-5.
Аналогично примеру 1 15 л среды
ML-19 ферментируют 72 ч в 150 колбах.
К собранному бульону добавляют 100 мг динатрийэтилендиаминтетраацетата и
2Ъ по весу Торсо PerCite, Topco М 34, после чего фильтруют через болыаую воронку Бухнера, получая 14,1 л бульоннбго фильтрата (рН 7,9) . Продукт загружают на колонну (DIAION) HP 20, 7 х 50.см, высокопористый стиролполивинилбенэоловый сополимер в виде псевдоожиженного слоя с крупносетчатой с.труктурой, промывают 7 л дистиллированной воды и элюируют 50Ъ по объему метанола.
Характеристики элюирования отно=ительно антибиотичного действия приведены в табл. 3. Загрузка 40 С< U/ìë х х. 14,000 мл.
17
18
738517
Продолжение табл. 3
2 5
105
17
50
75
19
50
50
38
22
50
50
50
10
26
27
28
29 рН
Остаточная активность, ф
3,0
4i0
5,0
9,0
6,0
79,0
76,5
7,0
8,0
88,5
9,0 82,0
Эти результаты показывают, что полученный в настоящем примере желтоваЭлюаты 99 8-14 соединяют, концентрируют до 100 мл при температуре ниже 30 С на ротационном выпарном аппарате и затем сушат замораживанием с получением 2,6 r желтовато-коричневого порошка. Этот порошок растворяют в дистиллированной воде с концентрацией 500 CCU/ìë.
Растворы на основе фосфатного буфера заданных рН получают доведением
15 М дикалийфосфата до необходимого значения с помощью 5 н. гидроокиси натрия или 5 н. фосфорной кислоты.
В 1 мл раствора антибиотика добавляют 1 мл фосфатного буфера и значение рН доводят до первоначального. Растворы антибиотика с изменением рН выдерживают 30 мин при 60 С в водяной бане, охлаждают под проточной водой и нейтрализуют до рН 7,0 небольшим количеством 5 н. гидроокиси натрия или 5 н. фосфорной кислоты. Контрольную трубку, содержащую раствор антибиотика РБ-5 с рН 7,0 помещают на ледяную баню на полчаса. Остаточную антимикробную активность замеряют описанным способом с применением в качестве подопытного микроорганизма
Comamonas terrigena В-996. токоричневый порошок заметно стабилен при рН диапазона 6,9-9,0 в течение 30 мин при 60 С.устойчивость айтибиотика повышается при более низких температурах даже при кислом рН. Так, например, после обработки антибиотика при рН 3,0 в течение " мин при
-17 C по меньшей мере ЗОЪ первоначального антибиотического действия еще можно установить.
Пример 3. Экстракция при низкой температуре н -бутанолом.
Большую испытательную трубку, содержащую 20 мл дистиллированной воды, 12 мл н-бутанола и 7 г хлористого натрия, охлаждают до -17 С без замораживания. Желтовато-коричневый пороItIoK антибиотика, полученный B примере
2, разбавляют до концентрации 200 мг/мл в дистиллированной воде и предварительно заморажиьают, 1 мл холодного раст20 вора антибиотика добавляют в эту испытательную трубку, быстро доводят рН до 2,75, 3, О или 3,25 с помощью серной кислоты и выдерживая температуру смеси ниже — 10 С . После тщатель25 ного перемешивания регенерируют
-бутаноловый слой и тщательно смешивают с 5 мл 0,5 М (рН 6,8), перенося активный компонент в водный слой.
Пример 4. Получение порошка .
gQ аналогично примеру 2 из 100 л бульонного фильтрата после сушки замораживанием получают 27,7 г желтовато-коричневого порошка антибиотика. Этот порошок (активность 13, 2 CCU/Mr) растворяют в 30 мл ?5 М фосфатного буфера (рН 6,8) и помещают на колонну из
QAE — Sephadex Ь-25 основная анионнообменная смола, полностью переведенная в четвертичное соединение, полученная вводом диэтил-2-оксипропилам-. мониевых групп в декстрановый гель; (3,3 х 25,0 см) . После промывки небольшим количеством того же фосфатного буфера активную фракцию элюируют тем же буфером, содержащим хлористый натрий в концентрации 0,5 М в хоце элюирования. Активную фракцию (300 мл) охлаждают до О C и обрабатывают 6 г активного угля. Активный уголь собирают, промывают водой и элюируют 50% IIQ
50 объему ацетона. По удалении, ацетона выпаркой при температуре ниже 30 С
727 мг коричневато-желтого порошка натриевой соли антибиотика регенерируют лиофилизацией.
55 Удельная активность препарата
264 CCU/ìr.
Пример 5. .Получение порошковой дэаэ-целлюлозы.
727 г полученного в примере 4, коричневато-желтого порошка антибиотика растворяют в 1 мл 25 М фосфатного буфера (pH 6,8) и загружают на колонну (1,5 х 27,0 см) из В10-Гее Р— 2 (поперечно сшитый синтетический сополимерный состав в виде катализирующего!
738517 слоя на основе метилен.-бис-акриламид ного сополимера, уравнонешенногс тем же фосфатным буфером. Проявляя тем же самым фосфатным буфером, получают активную фракцию в количестве 15 мл.
Полученную активную фракцию поме- 5 щают на колонну (2,5 х 28,0 см) из диэтиленминоэтиловой (ДЭАЭ) целлюлозы DE 32, уравновешенной тем же самым фосфатным буфером. Элюирование осуществляют линейным градиентом хлористого натрия н том же фосфатном буфере (0-0,5 М) . Полученную активную фракцию (240 мл) адсорбируют на 4,5 г активного угля,при О С. Активный уголь собирают фильтрацией, промывают водой и элюируют 50Ъ по объему ацетона. Ацетонный элюат выпаривают при температуре ниже 30 С до полного удаления ацетона, лиофилизируя затем с получением
120 мг коричневато-белого порошка натриеной соли антибиотика PS-5. Удельная активность этого препарата составляеr 600 CCU/мг.
Пример 6. Высокоочищенный препарат антибиотика.
Аналогично примеру 1 организм 2S
StrBptomgces A 271 культивируют в колбе Эрленмайера емкостью 500 мл, содержащей 100 мл среды SE-4 инокулируя затем в 30-литровый фермента ор, содержащий 15 л среды SE-4. Куль- 30 тинирование продолжают 24 ч при 28 С и 200 об/мин с принудительной аэрацией н объеме 7,5 л/мин, получая культуру семян.
2 емкости для ферментации емкостью Я в 200 л, выполненные из нержавеющей
"тали, наполняют каждый 200 л среды
YiL-19, содержащей 2,5% обезжиренной соевой муки, затем обрабатывают в авт.>клане, инокулируют 1 л посевной 40 культуры микроорганизма Streptomyces
А ?71, полученной описанным способом, и ферментируют 72 ч с аэрацией и перемешинанием. Содержимое обоих сосудов соединяют, смешивают с 5% по весу
Topco Per(ite, Topco N 34 (Topco
Per(ite Kogyo К.К.) и фильтруют через фильтр-пресс, получая 160 л бульонного фильтрата. Антибиотичный титр этого фильтрата оказывается равным
235 CCU/Më. Этот бульонный фильтрат пропускают через колонну из ионообменной смолы DIAION PA-306 (сильно основная анионнообменная смола с поперечно сшитой полиатироловой матрицей и триметиламмонийхлоридными звеньями) 10 х х 52 см, 4,5 мл нлажного объема без остатка. Затем активный продукт, пропущенный через зту колонну, адсорбируют на колонне из DIAION HP-20 (14 х х 97 см; 15 л) и элюируют 75Ъ метано- 60 ла. Собранный активный элюат (2 л, 9,854 CCU/ìë) трижды разбавляют 4 л воды и загружают на 2-литровую колонну (5,5 х 84 см) иэ DIAION РА-306S °
После промынки 500 мл воды антибиоти- Я ческий материал элюируют 8 л линейного натрийхлоридного градиента Π— 3% и собирают по фракциям в 200 мл. Активные фракции 99 17 — 31 собирают, получая 2,8 л активного элюата (4,120
CCU/ìë) . Этот элюат снова загружают на 1-литровую колонну из DIAICIN HP-20 (4,5 х 63 см) и элюируют 3-литровым линейным градиентом ацетона от О до
25%. Объем каждой фракции составляет
30 мл. Активный элюат (390 мл;
27,220 CCU/ìë) выделяют, соединяя антимикробно активные фракции
99 54-66 .
По удалении ацетона перегонкой под пониженным давлением элюат DIAIOQ
HP-20 пропускают через колонну емкостью 200 мл из QAE-Sephadex А-25 (2,5 х 41 см) . AHTHMHKpoGHoe активное вещество собирают по фракциям н
10 мл путем элюиронания 2-литровым линейным натрийхлоридным градиентом (0-1,5Ъ). Фракции -9 68 — 81 соединяют в качестве активного элюата (140 мл;
42, 120 CCU/ìë). рН этого элюата QAE — Sephadex A-25 осторожно доводят до 8, с применением 1%-ной гидроокиси натрия и загружают на колонну из 200 мл DIAION
HP-20AG (2,5 х 41 CM) . Элюирование линейным градиентом осуществляют с применением 1 л водного ацетона от
0 до 10%-ного. Объем каждой фракции составляет 10 мл. Фракции РР 48 — 53 соединяют, получая 60 мл активного элюата (45,000 CCU/ìë) . Сушкой заморажинают, получая 249 мг жел-ого порошка (8,000 CCU/ìã) .
В целях дальнейшей очистки 150 мг этого желтого порошка растворяют в небольшом количестне 0,01 М натрийсульфатного буфера (pH 8,0),,пропуская через колонну (130 мл; 1,5 х х 73 см) из Sephadex G-10 (декстрановый гель в виде катализирующего слоя, получаемый сшинанием декстра— новых фракций эпирхлоргидраном).
Антибиотик проявляют 0,01 М натрийфосфатным буфером (рН 8,0), фракци— нируя элюат. 36 мл активного элюата получают из фракций РР 38-55 (65,000 CCU/ìë).
Элюат Sephadex G-10 хроматографируют на колонне из QAE — Sephadex А — 25 (100 мл; 2,0 х 32 см) с последующим элюированием с применением линейного градиента посредством 1 л раствора хлористого натрия от О до 1,5Ъ-ного, Объем фракций — 10 мл. В качестве активного элюата собирают 5 активных фракций 99 48-52 (50 мл;
22,000 CCU/ìë). рН этого активного элюата осторожно доводят до 8,3 посредством 1Ъ-ной гидроокиси натрия и загружают на колонну из 50 мл DIAION HP — 20.(1,2 х х 44 см).
738517
Л „ „„= ca 246 nm (E„, = 82,0) Л „ с,,„= са 301 nm (E„= 267,5) 30
В водный раствор этого препарата (21,000 CCU/ìã) в дистиллированной воде добавляют гидроксиламиновый раствор (рН 7,5) для получения реакционной смеси, содержащей 21,3 мкг/мл 3 натриевой соли антибиотика и 10 мМ гидроксиламина. Через полчаса при
22 С реакционная смесь теряет около
94% первоначальной оптической плотности при 301 нм. 40
ИК-спектр поглощения.
Характерные максимумы поглощения наблюдаются при указанных длинах волн; около 1Т50 см " (-СО- в Р-лактамовом.кольце); около 1650 см- (-СО-1 в амидной связи); около 1640 см "1540 см " (-COd) .
ПМР-спектр. Нижеприведенные характерные сигналы получены в виде измерения: триплет с центром около 1, 06, частей/миллион (.J -около 7,5 Гц) (СН -СН -); мультиплет в области 1, 722
2,00 частей/миллион (СН -СН ): Резкий синглет около й,б частей/миллион (CH -СО-); мультиплеты в области 2,88-3,58 ч/м (-CH-, -СН-); мультиплет в области 3,9-4,20 ч/м (-СН-)
Цветовая реакция.
Реактив Эрлиха положительная реакция
То же
Отрицательная реакция.
Иодоплатинат
Нингидрин удельное вращение.
Натриевую соль антибиотика выделяют из фракций 5 мл элюированием линейным градиентом посредством 400 мл водного ацетона от 0 до 10%-ного.
Активные фракции 99 39-41 собирают и лиофилизируют, получая 51 мл белого порошка (21,000 CCU/ìã) .
Такой препарат на основе натриевой соли антибиотика представляет нещество белого цвета, растворимое н воде и нерастворимое в ацетоне. 10
При замере в аппарате для измерения микроточки плавления Кофлера ВУ-1 при повышении температуры со скоростью 1 С/мин этот препарат не показывает ясной точки плавления. Он становится желтым около 148 С и постепенно размягчается выше 160ОС. Около
203 С оттенок препарата медленно переходит из желтого в коричневый цвет. При 220 С вЂ” коричневая смола.
УФ-спектр поглощения. 20
60 мкг натриевой соли антибиотика растноряют в 3,0 мл воды, замеряя в спектрофотометре. Замеренные результаты, полученные расчетным путем следующие
R(f) 0,77
+ 1,23 (с 1,59, 0,01 М, рН 8)
I натрийфосфатный буфер.
Тонкослойная хроматографи8 (ТСХ) .
Натриевую соль антибиотика подвергают тонкослойной хроматографии в указанных условиях. Значения Rf определяют биоавтографией.
Целлюлозная ТСХ-пластина.
Система растворителей R(f) н -Бутанол (этанол) вода
7/7/б/по объему 0,94
Изопропанол/вода
7/3 по объему 0,96
Силикагельная ТСХ-пластина предварительно покрытая силикагельная пластина 60 F „,„ ) .
Система растворителей
Этанол/вода — 7/3 по объему 0,82 н-Пропанол/вода — 7/3 по объему
Бумажная хроматография.
Натриевая соль антибиотика дает следующие значения R(f) на фильтрующей бумаге Тоуо Fi6ter Paper И 50 в указанных услов иях
Система растворителей R(f) н -Пропа нол/вода — 7/3 по объему 0,68 н-Пропянол/изопропанол/вода — 7/7/б по объему 0,70
Ацетонитрил/вода — 8/2 по объему 0,36
Ацетонитрил/трис-буфер/
ЭДТА 0,34 (Смесь растворителей, состоящая из 120 мл ацетонитрила, 30 мл буфера на ос" нове M/10 трис(оксиметил)— аминометанхлористоводородной кислоты рН 7,5 и
1 мл М/10 этилендиаминтетраацетата рН 7,5)
Этанол-вода — 7/3 по объ ему 0,63
Высоковольтный бумажный электрофорез.
Натриевую соль антибиотика анаЭтизируют высоковольтным бумажным электрофсрезом в указанных условиях.
Фильтровальная бумага для анализа — Тоуо ГЫter Paper И 50.
Полученные результаты слет(ующие: при проведении электрофореза в течение 30 мин с охлаждением ниже 4 С при потенциале 42 В/см в буфере (рН
8,6), содержащем 3,3 г барбиталя и
25,5 г мединала в 3000 мл ноды, антибиотик мигрирует к аноду (28 мм) . эС вЂ” Магнитный резонансный спектр
Применяя в качестве внутреннего стандарта диоксан С -магнитный резонансный спектр натриевой соли антибиотика в тяжелой воде замеряют с помощью спектрометра. Получают следующие характерные сигналы: (1) (2) 23
738517
Таблица 4
Микроорганизмы
0,16
0,31
0,31
0„031
0,031
1,25
2,50
0,125
0,031
0,031
0,008
0i031
ВцззеИ
2,50
1,25
0,16
0,02
1,25
0,63
1,25
0,08
0,16
2,5
2 5
2,5
0,78
6,25
) 100
1,56
3,13
6,25
3,13
3,13
i100
)100
100
6,25
3,13
6,25
12,5
12,5
6,25
12, 5. 100 100
) 100
7100
7 100
12,5
12,5
6,25
1?, 5
3,13
100
6,25
12,5
25,0
Proteus sp. P — 22
Providencia sp. P-8
6,25
) 100
6,25
) 100
+ обра,зующий p -; 2 устойчив к анамицину, гентамицину и тобрамицину; 3 устойчив к гентамицину и тобрамицину, 4 + — в среде добавлено 10% лошадиной крови .
Примечание: (3) 169,29 (4) 141,11 1 (5) 130,40 (6) 67, 39 (диоксан) (7) 60,19 (8) 55,63 ° 5 (9) 40 „41 (10) 40,00 (11) 31,49 (12) 22, 62 (13) 22,46 10 (14) 11, 36
Антимикробный спектр действия. Значения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) натриевой соли антибиотика определяют на различных патоген- 5 ных .микроорганизмах, включая устойчивые штаммы, методом ра збавленного бульона.
Натриевую соль антибиотика растворяют в бульоне Brain Heart Dnfusion
Broth Eiken (рН 7,0) при концентрации порядка 5-50 мкг/мл, из которого изготавливают ряд разбавленных продуктов в той же жидкой среде. Микроорганизмы культивируют 18 ч в 6ульStaphylococcus aureus FDA 209P
Smith
ВХ-1633
4i
Dip2ococcus pneumoniae Type III
Streptococcus pyogene s МУ вЂ” 5 .4
Baci22 us subtiCis ATCC 6633
Escherichià cori К 12
A2ca2igenes faeca2is В-326
Citrobacter Гreundii E-9
Serratia marcescens S-18
Klebsiella pneumoniae К-2
Entегоbacter sp. Е-8
Entегоbacter c2oacae E 16
Entегоbacter aегоgenes Е-19
Proteus vutgaris P-5
Ф
Proteus mirabikis P-6
2> Ф
Proteus rettgeri P — 7, сне Brain Heart gnfusion Broth"Eiken" о при 28 С при окончательном размере прививочного материала lх10 клеток/мл.
Культуре дают стоять 20 ч при
35"С, после чего регистрируют рост микроорганизма каждого образца разбавленного антибиотика. МИК показывает минимальную концентрацию антибиотика (натриевой соли его), где визуально нельзя определить размножения основного микроорганизма. В качестве контроля 2 известных ) -лактамовых антибиотика — цефалоридин и цефокситин растворяют в бульоне brain heart
infusion broth (pH 7,0) при концентрациях порядка 1-100 мкг/мл и затем разбавляют в целях получения ряда разбавленных культур в приведенной жидкой среде. Эти образцы обрабатывают способом, описанным для определения МИК.
В табл. 4 приведены полученные результаты(дополнительно к значениям
МИК антибиотика для сравнения включены данные для цефалоридина и цефокситина) .
Минимальная ингибирующая концентрация, Мкг/мл
Антибиотик Цефалоридин Цефокситин
738517
26 ния мм
Микроорганизм пеницилином
26,0
24,5
22,2
l8,3
318
16,0
14,0
159
100
10,3
79,5
318
22,0
17,5
13,8
11,0
20,1
17,2
13,8
11,0
159
100
79,5
20,8
17,2
13,2
23,0
19,2
-15,2
13,1
159
79,5
10,4
21,3
17,8
13 0
22,1
22,0
16,1
13,8
159
100
79,5
Proteus sp. P-22
21,4
18,2
13,8
12,8
318
13,6
11,7
159
79, 5
Усилие антимикробного действия известных Р -лактамовых соединений против микроорганизмов, устойчивых к -лактаму.
10 мл расплавленного питательного агара, содержащего 50 мкг/мл пенициллина G или цефалоридина, 0,8% бульонного порошка Kyoto Nutrient Broth
Powder и 1,0% агара Difco Bacto Agar (pH 7,0) засевают микроорганизмами, устойчивыми к р -лактаму и образующйми р-лактамазу, выливая затем в чаш ку Петри (9 см) в целях получения биоиспытательной агаровой пластины.
Устойчивый к 8 -лактаму
Proteus vuEgaris P-5
Entегоbacter sp. Е-8
Citrobacter freundii E-9 318
Serratia marcescens S-18 318 Ha эту агаровую пластину помещают пульповые кружки (8 мм), содержащие ,каждый 25 мкл растворов антибиотика
PS-5 в заданной концентрации, после чего инкубируют при 35 С в течение
18 ч перед регистрацией эон ингибирования, Контрольную испытательную пластину изготавляют аналогично, но с беэ пенициллина G или цефалоридина.
„B контроле на пластинах испытывают в тех же условиях пенициллин G, ам.пициллин, оксациллин -и цефазолин.
В табл. 5 и 6 приведены полученные результаты.
Таблица 5
27 738517 Габлицаб а ингибирования, мм
Aíòèá тик
Микроорганиэм, уст чивый к -лактаму цефал идина алоном (мкг/мл) 318
Entегоbacter. sp, Е-18
21,0
21,9
19,4
159
18,2
100
18,0
17,6
l6 1
15,1
79,5
Citrobacter freundii Е-9 318
159
100
79,5
16,0
318
21,0
17,0
Serratia marcescens
159
100
16,8
14,8
79,5
Proteus vutgaris P-5
318
25,2
24,0
159
100
22,0
21,8
79,5
Пенициллин G, мкг/мл
10,000 14,9
14,5
2,500 0
625
Лмпициллн, мкг/мл
10,000 . 14,37
12,9
2,500 0
625
Оксациллин, мкг/мл
10i000 0
2,500 0
625
0цвфазолин, мкг/мл
- 10,000 14,6
12 i0
2,500 0
625 наблюдается силънсе ингибирсвание Ртссесв чсбнаг1а Р-б-б-лаитамазн инпенициллиназы микроорганиэма Proteus гибируется. чпEgaris за счет действия антибиотика. При наличии 1/42 эквивалента ан- Пример 7 ..Способ получения тибиотика в пенициллине G в качест- препарата тритилового сложного эфира
Эе субстрата более 50% активности 65 антибиотика.
22,5
17,4
17,4
18,5
15,2
13,7
12,5
24,6
22,3
21,6
19,4
26,1
24,8
23,3
22,3
738517
3030,0 г желтовато-коричневого лиофилизированного порошка натриевой соли антибиотика (удельной активности
27 CCU/Mã) растворяют в 100 мл диме° тилформамида с добавлением 3,0 г триэтиламина, Охлажцая льдом, в реакцион- > ную смесь добавляют 9,0 r тритилхлорида с выдерживанием температуры раствора ниже 5 С. После перемешивания в течение 12 ч при 5 С весь активный материал антибиотика превращается в продукт тритилирования..Реакционный раствор выливают в 1000 мл 0,5 М фосфатного буфера (рН 6,8), экстрагируя затем трижды 1000 мл этилацетата в каждом случае. Этилацетатные экстракты. соединяют, дегидратируют fS безводным сульфатом натрия и выпаривают досуха при пониженном давлении.
Остаток от выпарки растворяют в 20 мл бензола и пропускают через колонну из Bio-Beads S — ХЗ (пористый слой Z() стиролдивинилбензольного сополимера для гельпермеации; 4,5 х 60,0 см), которую предварительно уравновешивают бензолом. Колонну проявляют бензолом.
Активная фракция, показывающая анти- д5 биотичное действие на испытательной пластине Comamonas концентрируется досуха при пониженном давлении. Полученный остаток растворяют в 1 мл бензола и загружают на силикагелевую колонну (25 г; 1,5 х 24,0 см).
После промывки бензолэтилацетатной .смесью (10:1) в целях удаления ос таточных реактивов, активный материал элюируют бензолэтилацетатной смесью (1:2) . Активный элюат выпаривают досуха под пониженным давлением и снова растворяют в 0,5 мл бензола. Бензольный.раствор помещают на нейтральную колонну из окиси алюминия и проявляют бензолэтилацетат- 40 ной смесью при различных соотношениях (10:1, 6:1, 4:1, 3:1, 2:1 и 1:1).
Активные элюаты соединяют и выпаривают досуха при пониженном давлении.
Остаток от выпарки растворяют в 45
0,3 мл бензола, загружают на силикагелевую колонну (10 г,. 0,9 х 22,0 см)
По удалении примесей с помощью бензолэтилацетатной смеси (10:1) активный материал элюируют бензолэтилацетатной Я смесью (1:2) и концентрируют под пониженным давлением с получением твердого порошка. Полученный порошок растворяют в 0,5 мл бенэола и очищают на колонне Bio-Beads S — ХЗ. (1,2 х 55
96 cM) с применением бензола в качестве агента проявления. Активный элюат выпаривают досуха в вакууме. Полученный сухой порошок растворяют в
0,5 мл ацетона и подвергают гель.фильтрации с применением колонны
Sephadex ЬН-20, декстрановый гель в виде слоя, получаемый поперечным сшиванием декстра новых цепей оксипропилированием (1, 2 х 96,0 см), которую предваритель но наполняют ацетоном до взбухания. Активную фракцию выла= ривают досуха, получая 23 мг белого порошка. Перекристаллизацией этого порошка из бензолгексановой смеси получают 12 мг бесцветного кристаллического порошка-продукта (10, 800 CCU/ìë) . Бесцветный кристаллический продукт является тритиловым сложным эфиром антибиотика.
Растворимость продукта тритилирования антибиотика определяют растворением со встряхиванием 5 мг в каждом случае продукта тритилирования антибиотика PS-5 в 0,1 мл каждого из испытуемых растворителей при 20 С.
Результаты следующие: в основном не растворяется в воде, Н -гексане и петроле йном эфире (т. кип. 30-6 0 С) . Высокорастворим в бензоле, этилацетате, хлороформе, мета ноле., эта ноле, аце тоне, диметилформамиде (ДМФ) и диметилсульфоксиде (ДМСО) .
Устойчивость. Тритиловый сложный эфир антибиотика растворяют в 1 единице по объему метанола, разбавляя затем 9 единицами по объему дистиллированной воды, как только оказывается возможным получить раствор
125 CCU/ìë 10 М раствор дикалийфосфата обрабатывают 5 н. фосфорной кислотой или 5 н. гидроокисью натрия до достижения рН 3-9.
К 1 мл кажцого из фосфатных буферов побавляют 1 мл каждого из упомя нутых растворов тритилового сложного эфира антибиотика1 в соответствующем случае рН смеси подрегулировывают до требуемого значения с применением фосфорной кислоты или гидроокисью натрия.
Раствор смеси вЫдерживают в водяной бане 30 мин при 60 С, охлаждают про-. точной водой и нейтрализуют до рН 7,0 небольшим количеством фосфорной кислоты или гидроокиси натрия.
Контрольный раствор (рН 7,0) выдерживают на ледяной бане на протяжении всего опыта. Остаточный антибиотичный материал испытывают обычным биоиспытательным методом с применением в качестве подопытного микроорганизма Comamonas terrigena В-996.
Продукт тритилирования антибиотика плавится при 83,5-85,5 С, постепенно становясь коричневым при температуре выше 14 0 С.
УФ-спектр поглощения продукта тритилирования антибиотика согласно изобретению регистрируют с помощью спектрофотометра при концентрации
128 мкг/3 мл метанола.
IAs0H По
Л. = 315,5 пю(Е„ = 156)
Характерные максимумы поглощения наблюдаются при следукщих диапазонах длины волн:
3430, 3100-3000 (С-Н фенильной группы); 2990,2950,1770 (С-О р-лактамово738517
Положительно
Отрицательно
Положительно
0,56
1,0
Таблица7 кг/мл
Микроорганизм
a0oxi—
pici
pin пе
0,20
0,17
0,27
0,08
0,17
0,04
0,04
0,20
0,04
0,01
0f01
0,05
0,02
0 05
3,13
0,27
5,37
2.5 го кольца); 1695 (-CO-амидной связи);
1665 (-СО-О, сложноэфирной связи.);
1445, 1340, 1275, 1130 спГ ., IINP-спектр. Самые характерные сигналы следующие: триплет около 1,10 ч/м (3 — около 7,0 Гц); синглет при 5
1,86 ч/м," мультиплет в области 7,10- .
7,56 ч/м (протоны в бензольном кольце тр ит ило в О и группы)
Ф
Элементарный анализ.
3, 5 Ml продукта тритилирования ан- 10 тибиотика сушат при комнатной температуре 4 ч при пониженном давлении
). х 10 мм рт. ст. и подвергают элементарному анализу, Иайдено, С 61,89о; Н 5,78%; 15
N 4, 48Ъ; $4, 62%. цветовая реакция.
Ре актив Эрлиха
Трифенилтетразолийхлорид Отрицательно
Хлорид желе за Отрицате,льно
Хлористое железойод
Йздплатинат
Гидроксиламинхлористое железо Положительно
Хлортолидин Положительно
Нингидрин Отрицательно
Тонкослойная хроматография (ТСХ) °
Тритиловый сложный эфир антибиотика дает следующие значения R в задан- З0 ных условиях. Сторону миграции определяют биоавтографией íà Comamonas terrigena В-996.
Силикагельная ТСХ: пластина предварительно покрытая,силикагельная 35
60 Р»4.
Система растворителей: бензол/ацетон (2:)) R ." 0,29.
Цзллюлозная TCX: пластина Eastman
Chromagran Sheet 13254 Се Извозе с 4Р флуоресцентным реактивом., Индикатор (N0 6065).
Растворитель R(f)
Верхняя фаза н -бутанол/
/этанол воды (4:1:5) 45 н -Бут анол
Staphylococcus aureus FDA 209 р
Staphyf ococcus aureus Smith
DipEococcus pneumoniae Type III
Streptococcus pyogenes NY-5
Sacrina (utea S-19
Escherichia cori К 12
Изопропанол/вода {B:7) 0,9)
Изопропанол/вода (1:4)
Молекулярная структура антибиотика и приведенные физико-химические свойства подтверждают структурную фо,. мулу тритилового сложного эфира антибиотика.
Биологические свойства тритиловог<., сложного эфира.
Антимикробный спектр действия.
Значения МИК соединения определяю на различных патогенных микроорганизмах, включая определенные устойчивые штаммы, с примене нием метода разбавл ния бульона.
В частности тритиловый сложный эфир антибиотика растворяют в небольшом количестве метанола и разбавляют, как только становится возможным в бульоне Brain Heart Jnfusion Broth Eiken до концентрации тритилового сложного эфира антибиотика порядка 40-20 мкг/мл. Концентрация метано- ла в целевом растворе не превышает
10%. Этот раствор разбавляют согласно двукратному геометрическому ряду..
Микроорганизмы, приведенные в табл.. 7, культивируют 18 ч при 28 С в бульоне и инокулируют с получением серий разбавленного продукта с окончательным размером прививочного материала
1 х 10 клеток/мл. Результаты регист5 рируют после инкубации при 35 С в течение 20 ч. Значения МИК показывают низшую единицу концентрации продукта тритилорования антибиотика, когда не наблюдается роста соответствующих микроорганизмов в описанных условиях. В качестве контрольных антибиотиков изготавливают растворы ампициллина и цефалоридина при концентрации
100 мкг/мл с обработкой, аналогичной обработке соедине ния согласно изо бретению.
В табл. 7 сведены значения МИК тритилового сложного эфира антибиотика вместе с таковыми ампициллина и цефалоридина в качестве контроля.
34
738517,Продолжение табл. 7
МИК, мкг/мл
Микроорганизм
1,25
0,25
6,25
7100
)100
10,0
50,100
10,0
10,7 100 100
10,0 100
)100
10,0
7100 8,7
)100 .
)100
21,5
21,5
720, 0
7100
3,13
10,0
10,0
50 0
> 20,0 !
)43,0
50,0
50
AtcaLigenes йаесаК1з В-326
Citrobacter f reundie Е-9
Serratia8 marcescens S-18
KRebsie Ыа pneumonial К-2
Entегоbacter sp. E-8
Entегоbacter с1оасае Е-16
Entегоbacter aегоgenes Е-19
Proteus vu3garis P — 5
Proteus ппгаЬИ1з Р-6
Proteus генgeri P-7
Pseudomonas aeruginosa P-1
Как видно из таблицы, тритиловый . сложный эфир антибиотика оказывает широкое антимикробное действие, в частности сильное антибиотичное действие на различные штаммы микроорганиз- З5 мов, устойчивых к P -ëàêòaìó (образующих р-лактамазу) .
УСИЛЕНИЕ ДЕИСТВИЯ ТРИТИЛОВОГО СЛОЖНОГО ЭФИРА AHTHEHOTHKA HA АНТИВИОТИ- 40
ЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ПЕНИЦИЛЛИНОВЫХ И
ЦЕФАЛОСПОРИНОВЫХ СОЕДИНЕНИИ ПРОТИВ
УСТОЙЧИВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ:
Испытательные чашки Петри (диаметром 9 см), содержащие устойчивые микроорганизмы, получают нанесением
10 мл расплавленного питательного агара с посевом микроорганизмов ус-,, тойчивых к р-лактаму (образующих
Р-лактамазу), на твердый основной слой питательного агара (рн 7,0
15 мл), .содержащего 50 мкг/мл пенициллина G или цефалоридина. Испы
1ritye (AmpiciI) .Cephalori
PS-5 lin dine туемые антибиотииные раотворы помещают на пульповый кружок (8 мм) в крличестве 25 мкл и затем на испытательные пластины. После инкубации при .
35 С в течение 18 ч замеряют зону ингибирования и сравнивают С результатами на соответствукших пластинах, не содержащих ни пенициллина G, ни цефалоридина.
В табл. 8 приведены результаты, Из данных табл. 8 совершенно ясно, что комбинация продукта тритилирования антибиотика в концентрации нияе нижнего предела биологического опыта с пластинами с пенициллином G или дефалоридином в концентрации ниже этого предела дает значительную зону ингибирования. Этот факт ясно подтверждает усиление антибиотического действия пенициллина G или цефалори,цина продуктом тритилирования антиби отика..Зс
73851 i т а б л и 3.3 а <.
Proteus чп (уаг1в P-5
15,0
18,0
11,5
13,5
15,5
100
11,0
Proteus sp. P — 22
100
13,0
100
16,0
18,0
Микроорганизм, устойчивый к -лактаму
Proteus vuCgaris
P — 5
С .trobacter freundii Е-9
Подтвер дение антимикроьного синер гизма продукта тритилирования антибиотика и цефалоридина путем метода разбавления бульона на штамме Proteus
vu6garis, устойчивом против 5-лактама
Штамм Proteus vuEgaris P-5, устойчивый к 1 -лактамовым соединениям за счет образования Р-лактамазы, поэто-ЭО му применяют сочетание 7,5Ъ МИК цефа лоридина с 12,5% МИК тритилового сложного эфира антибиотика, что ингибирует рост подопытного микроорганизма.
Активность на живом организме про- 35 дукта тритилирования антибиотика замеряют на мышах, инфицированных внутрибрюшинно организмом Staphylococcus
aureus Smith в количестве 5 х 10 кле3 ток на Зышь. Тритиловый сложный эфир у0 антибиотика вводят подкожно непосредственно после заражения. 50Ъ-ная лечебная доза у мышей-самцов составляет 2,55 мг/кг (27 540 CCU/êã).
Ингибирующее 3-лактамазу действие.. 45
БОЪ гидролизата цефалоридина ингибируется посредством 060 и 080 MKr/мг продукта тритилирования антибиотика
PS-5 в ходе опыта Р-лактамазой Pro—
teus vuEgaris P-5 и Citrobacter
freundii Е-9, соответственно.
Токсичность. Тритиловый сложный эфир антибиотика PS-5 не вызывает смертельного- действия у мышей-самцов при внутрибрюшном введении в количе55
cTâå 500 мг/кг.
II р и м е р 8. Способ получения продукта тритилирования,антибиотика
Р Б- 5
Коричневато-желтый порошок натриевой соли антибиотика PS 5 (715 мг, 60
235 CCU/ìã), полученный аналогично примеру 4, растворяют в 3,5 мл гекcaMeTèëôîcôoðòpèàìèäа. По доб влении
70 мг триэтиламина с охлаждением льдом, в смесь добавляют 250 мг тритилбромида при темпеРатуре ниже 10оС о
Смесь перемешивают при 10 С в течение 7 ч в целях завершения реакции тритилирования. Ре акционную смесь выливают в 50 мл ледяной воды и выдерживают до расплавления твердого льда.
Тритиловый сложный эфир антибиотика трижды экстрагируют с применением
15 мл бензола (каждый раз) и обрабатывают аналогично примеру 7, получая
9,4 мг бесцветного кристаллического порошка. Физико-химические свойства этого препарата аналогичны примеру 7.
Пример 9. Получение продукта тритилирования антибиотика в присутствии CROWN-эфира.
Сырой коричне в ато- белый порошо к (1 О, 1 г) лиофилиз ации, получе нный аналогично примеру 2, взвешивают в
200 мл хлористого метилена и растворяют с перемешиванием и добавлением
1 мл 15 — Crown — 5.
Выдерживая температуру раствора ниже 5 С с помощью льда, добавляют
8,5 г тритилхлорида. Реакционную смесь нагревают до комнатной температуры и перемешивают 3 ч. После фильтрации фильтрат выпаривают досуха при пониженном давлении. Остаток растворяют в 10 мп бензола за один прием, фильтруют и очищают аналогично примеру 7, получая 7,3 мг бесцветного кристаллического порошка.
Пример 10. Способ получения продукта тритилирования антибиотика в присутствии четвертичной аммониевой соли.
Антибиотик экстрагируют из 48 л бульонного фильтрата (11,7 CCU/ìë) два раза " "применением 15 л в каждом случае дихлорметана, содержащего ,0,05% цетилдиметилбензиламмонийхлориЗца (активность дихлорметанового экст738517
Формула изобретения
254
О - 30н
Л = 315,5 nm
maХ тракта 24,0 ССУ/мл; активность исполь зуемого бульонного Фильтрата.
5,7 CCU/ìë). Дихлорметановый экстракт сушат 400 г безводного сульфата натрия и выпаривают до 500 мл под пониженным давлением на ротационном 5 выпарном аппарате. Концентрат (450 CCU/Më) дегицратируют вначале
10 г безводного сульфата натрия, а затем по фильтрации — 5 г молекулярного сита 4 A. l0
В этот сухой раствор добавляют
4, 5 г тритилхлорида при температуре ниже 5 С, перемешивая смесь 5 ч при
5 С. По удале нии дихлорметана выпаро кой при комнатной температуре, остаток растворяют в 15 мл бензола и очищают аналогично примеру 7, получая 8 мг бе зводного кристаллического порошка тритилового сложного эфира антибиотика. Физико-химические свойства этого препарата почти идентичны с таковыми приме ра 7.
Пример 11. Метиловый сложный эфир антибиотика.
90 мг натриевой соли антибиотика, полученной аналогично примеру 6 (8,000 CCU/ìã), взвешивают в 3 мл сухого диметилформамида, добавляя затем
50 мг триэтиламина и 0,3 мл йодистого метила. После перемешивания в течение
2,5 ч при комнатной температуре до- () бавляют 100 мл бензола, тщательно перемешивая для экстрагирования. Бензольный слой отделяют, промывают 100 мл
0,1 М (рН 6,8) и затем сушат безводным сульфатом натрия. Сухой бензольный ра-5 створ концентрируют до небольшого объема под пониженным давлением и загружают на колонну (1,2 х 90 см) из
Bio †Beea Я-ХЗ.
Метиловый сложный эфир проявляют бензолом. Элюатные фракции содержащие сложный эфир, соединяют и выпаривают досуха под пониженным давлением, получая бесцветное масло. Маслянистый продукт растворяют в небольшом количестве ацетона и хроматографируют на колонне (1,2 х 90 см) Sephadex LH-20 ацетоном в качестве проявителя. Элюатные фракции, содержащие метиловый сложный эфир антибиотика, собирают и выпаривают досуха, получая 11,2 мг метилового сложного эфира антибиотика. Метиловый сложный эфир отличается следующими физическими и химическими свойствами.
Тонкослойная хроматография. R1 — 0,45 (силикагельная пластина 60 бензол : ацетон = 1:1).
УФ-спектр поглощения: максимум метаноле
ИК-спектр поглощения: максимум в
<лороформе 3430, 1766, 1660 см-"
Сигналы в ПМР в дейтерийхлороформе (Ю) 1, 05 (3 Н, t, J = 7, 5 Hz);
1, 7-2, О (2Н, m); 2, 00 (3 Н, S); 2, 83 65 (7 Н, m); 3,83 (3 Н, S); 3,844,06 (1 Н, m).
Молекулярный вес (масс-спе ктрометрия высокой степени разрешения) .
Найдено: 312,1131.
С14. Н 2оИ204Я
Вычислейо; 312, 1143 °
На основе приведенных данных метиловый сложный эфир антибиотика действительно соответствует структурной формуле II, указанной выше, где R— метил.
Прием, описанный в примере 2, повторяют с применением этилйодида, изопропилйодида, изобутилйодида, н-пентилйодида или н-гексилйодида вместо метилйодида, получая сложные эфиры антибиотика этиловый, изопропиловый, изобутиловый, -пентиловый, м -гексиловый сложный эфир.
Образование этих сложных эфиров подтверждается тонкослойной хроматографией, ИК-спектрометрией поглощения, ПМР-спектрометрией и масс-спектрометрией.
Составы, содержащие антибиотик и/или тритиловый сложный эфир антибиотика, можно вводить в разных единичных дозах, как твердых или жидких, оральных формах для проглатывания.
Эти составы содержат на единичную дозу, жидкую или твердую, активный ма гериал в количествах от 0,1 до 99%, предпочтительно, 10-60%. Количество активного ингредиента в составе может колебаться в зависимости от вводимой формы и общего веса состава, причем обычно колеблется в пределах диапазона 10-1000 мг, предпочтительно, 100-1000 мг.
В парентеральных составах единичная доза является обычно чистым или высокоочищенным антибиотиком, его фармацевтически совместимой солью и/или продуктом его тритилирования в растворе в стерильной воде или же в виде растворимого порошка, предназначенного для растворения. Активный продукт мажет вводиться также и в сочетании с соединениями, ччвствительными к Р-лактамазе.
Предлагаемый способ позволяет получить новый антибиотик.
Способ получения антибиотика общей формулы 4H3 СН
2 и — сн -сн -мн-со- сн, N
О eQ0E где R. — водород, металл, алкил или трифенилметил, з а к л ю ч а ю73854 7
Составитель С, Мамонина.
Редактор A. Соловьева Техред М.Петко Корректор В. Бутяга
Тираж 522
Заказ 2856/41
Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 шийся в том,.что штамм Streptomyces А 271 выращивают в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли,при рН 4,0-9,0 и температуре 20-40 С с последующим выделением целевого продукта в виде кислоты или в виде сложного эфира или соли.
