Способ регенерации растений люцерны

 

Взамен pэ:;т е нэд,1;,!.<

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 2811.78 (21) 2712085/30-15 с присоединением заявки Й9 (23) Приоритет

Опубликовано 3006.81, Бюллетень М 24

Дата опубликования описания 3 0681 (51)М. Кп.

А 01 Н 3/00

Государственный комитет

СССР ио делам изобретений и открытий (53) УДК 581.143 (088.8) (72) Автор изобретения

A.Â.ÌåçåHöåâ (71) Заявитель

Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени научноисследовательский институт кормов им. В.P .Вильямса (54 ) . СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ PACTEHHA ЛЮЦЕРНЫ

° ° 1 л т тъттттт .т

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в селекции и семеноводстве, в частности для соматической гибридизации, в исследованиях по фитопатологии физиологии и генетике растений.

Известны спссобы получения изолированных протопластов люцерны из мезофилла и, кончиков корней путем воздействия целлюлолитическими и пектолитическими ферментами в растворе осмотиков (1) .

Однако способы регенерации растений люцерны из протонластов неизвестны.

Известны также способы регенерации растении из изолированных протоПластов табака, моркови, картофеля и некоторых других культур (2).

Однако эти способы оказались неприемлемыми для люцерны, что связано со специфическими требованиями данной культуры к питательным средам и условиям инкубации.

Известен также способ:регенерации растений люцерны из каллусов листового происхождения на агаризованных питательных средах (3).

Однако этот способ оказался неиз протопластов люцерны, так как каллусы и протопласты имеют существенные различия в отношении пита— тельных сред и условий инкубации, способствующих образованию регенерантов.

Целью изобретения является получение регенерантов иэ протопластов для последующей генетической модификации растений.

Поставленная цель достигается тем, что иэ каллусов листового проИсхождения выделяют протопласты и инкубируют в жидкой питательной сре15 де Гамборга В- с фитогормонами 1824 ч в темноте, а затем 5-7 недель при освещенности 400-600 лк с еженедельным добавлением свежей питательной среды без осмотика до обра2О зования многоклеточных колоний, которые переносят на агаризованную питательную среду Гамборга В с фи5 тогормонами, и после образования из них каллусов последние пересаживают на среды, способствующие регенерации растений.

Причем в жидкую питательную среду

Гамборга В в качестве осмотика вводят 8500045000 мг/л D-маннита, а в

4А v ucттло йитоглвмонотт. 1.0-1.5 мг/л

743647

Макрозлементы

КИО,„

Нанар04 Н20 (И Н 4 )g 5 0

SgSO4. 7Н О

СаС1р ° 2Н20 е504 ° 7Н О

Трилон Б.2500

134

28

Микроэлементы

МпSO< Н О н .80

7п504 7Нп 0

Na HoO> ° 2Н О

С uSOg, 5Н О

CoC1, 6Н О к3

2

0„25

О,, 025

О,. 025

0,,75

Витамины

Никотиновая кислота 1

Тиамин НС1 10

Пиридоксин НС! 1

Миоиноуит 100

Сахароза 20000

Материал инкубируют 3 недели при непрерывном освещении люминесцентными лампами (освещенность 0,54,0 тыс.лк), температуре 26+1 С и относительной влажности воздуха 951000о ов закрытых прозрачных сосудах.

В случае появления на листочках бактериальной или грибной инфекции их удаляют с частью прилегающей к ним питательной среды, вирусная инфекция устраняется под воздействием фитогормонов.

Развившиеся каллусы переносят в раствор ферментов с осмотиком, содер жащий, вес.Ъ: .

2,4-0, 0,5-0,75 мг/л кинетина и 0,20,8 мг/л бензиламинопурина, а в агаризованную среду Гамборга Вб в качестве фитогормонов вводят 0,61,0 мг/л бензиламинопурина и С,З0,5 мг/л индолил-3-уксусной кислоты..

Способ осуществляют следующим образом, Листочки, то есть пластинки тройчатого листа культивируемых сортов и гибридов люцерны стерилизуют в

0,13-ном водном растворе диоцида и после трехкратной промывки в стерильной дистиллированной воде делают на каждом из них ряд над1»езов по всей площади пластинки и помещают на основную питательную среду Гамбор- 15 га В> (О.L Gambora et al. Experumentall ce11,-,Research, 50, 1, с. 151158, 1968), в которую дополнительно вводят 6000-8000 мг/л бактоагара и 200-300 мг/л нитрата аммония, содержание сахарозы увеличивают до

25000-35000 мг/л и вносят следующие фитогормоны, мг/л: 2,4-0 дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-0) 8- Lá, кинетин 6-10 иск -нафтилуксусная кислота (НУК) 0,1-0,5. рН среды доводят до 5,8-6,0.

Состав среды Гамборга Вб {pH 5,5) представлен ниже, мг/л:

Освещенность, лк:

О, (темнота) Образование колоний и развитие каллусов

Не образуются

Целлюлоза 4,0 — 5,0

Пектиназа 2,0-2,5

Хлористыи кальций СаС1 бН О 5,0 — 5,5

Вода

В атОм растворе каллусы двобят до образования однородной сусле эии и затем инкубируют в темноте г„... температуре 26+1 С в течение 14-16 ч.

Выделившиеся протопласты отделяют от грубых примесей путем фильтрования через двухслойную капроновую сетку с диаметром отверстий 125 мкм, а затем отделяют от раствора ферментов че ырехкратным центрифугированием (135-160 g), используя для промывки

5,0 — 5,5Ъ-ный раствор хлористого кальция {CaC1> 6Н20).

После центрифугирования и удаления.супернатанта (недостаточная жидкость) к изолированным протопластам добавляют жидкую среду Гамборга B содержание сахарозы в которой увели— чивают до 25000 — 35000 лг/л, дополни— тельно вводя-. oc:лотик D-маннит (85000 †950 мг/л) и фитсгормоны, мг/л: 2,4 — 0 1 — 1,», кинетин 0,5-0,75 и бензиламинопурин (БЛП) 0,2-0,8, рН среды доводят до 6,0.

Изолированные протопласты инкубируют в закрытых прозрачных сосудах

18-24 ч в темноте, а затем при непрерывном люминесцентном освещении (400 †6 лк) при температуре 26 -1ОС и относительнои злажности воздуха

95 †10 и добавляют в течение инкубации (5-7 недель) через каждую неделю 10-15 вес,-. свежей питательной среды того же состава, но без

D-маннита, 2,4 †и кинетина.

После образования из протопластов клеточных колоний {более 32 клеток в каждой) их переносят на среду

Гамборга В5, в которую вводят бактоагар 8000-10000 мг/л, содержание сахарозы увеличи:вают до 2500035000 мг/л и.добавляют 0,6 — 1,0 мг/л

БАП и 0,3-0,5 мг/л индолил — 3-уксус— ной кислоты (ИУК) и инкубируют при тех же условиях, но освеще:HocTb увеличивают до 3000-4000 лк.

Изолированные протопласты люц<- рны после выделения инкубируют в темноте 18-24 ч, так как на свету большая часть протопластов повреж— дается. При выдерживании протопластов в темноте больше 24 ч замедляется темп клеточных делений. Образование колоний из протопластов и каллусов из колоний происходит только в условиях оптимальной освещенности.

Ниже приведены результаты влияния освещенности на образование многоклеточных колонии из протопластов и развитие каллусов„из колоний.

743647

100-300

400-600

700-1500

2000-2500

3000-4000

5000-10000 40

55

Не образуются

Колонии образуются в течение 5-7 недель, каллусы не образуются

Колонии образуются в течение 5 — 7 недель, каллусы образуются в течение

5-6 недель .Колонии не образуются, каллусы образуются в течение

4-5 недель

Колонии не образуются, каллусы образуются в течение

2-3 недель

Не образуются

Таким образом, оптимальная освещенность при инкубации протопластов до момента образования многоклеточных колоний колеблется в пределах 400.1500 лк, однако с целью экономии электроэнергии используют освещенность 400-600 лк. Быстрое образование каллусов из многоклеточных колоний (через 2-3 недели ) наблюдается при освещенности 3000-4000 лк, уменьшение освещенности значительно замедляет процесс каллусогенеза.

Образовавшиеся из клеточных колоний каллусы переносят на среду того же состава, которая применялась для получения каллусов из листочков и инкубируют в течение 2-3 недель, а затем разросшиеся каллусы переносят на среду Гамборга В, в которую вводят 6000-8000 мг/л бактоагара, содержание сахароэы увеличивают до

25000-35000 мг/л и добавляют 0,20,8 мг/л БАП.

Образовавшиеся на каллусах зеленые эмбриоиды (соматические зародыши) переносят на среду того же состава беэ фитогормонов. Условия инкубации остаются прежними, но длину фотопериода.сокращают до 16 ч в сутки. По мере развития растений на этой среде и поянления у них двух-трех тройчатых листьев и корней их пересаживают в почву и выращиьают в обычных услони ях .

Пример. Проводилась регенерация растений из протопластов, выделенных из каллусов листового происхождения, гибридной люцерны сортон

Рамблер и Зайкевича и желтой сорта

Дединовская. При этом были получены следующие результаты: 90% листочков, помещенных на питательную среду с тремя фитогормонами, образовали каллусы. Последние помещали в раствор ферментов с осмотиком, содержащий вес,%: целлюлоза Onorukap 1500 4,0 пектиназа Serva 2,0, хлористый каль ций (СаС1 - 6Hg0) 5,5 и вода 88,5.!

О

3О

З5

Раствор стерилизовали фильтрованием через стеклянный фильтр 3G5 (Schott and Cen, Jena, DDR). По

2 мл раствора заливали в чашки Петри (60x12 мм) и помещали туда по 1 каллусу, затем дробили его шпателем до образования однородной суспензии и инкубировали в течение 14-16 ч в темноте при температуре 26+10 С. Выделившиеся протопласты отделяли от грубых примесей путем фильтрования через двухслойную капрононую сетку с диаметром отверстий 125 мкм. Изолированные протопласты отделяли от раствора ферментов четырехкратным центрифугиронанием (150 g), используя для промывки 5,5Ъ-ный раствор хлористого кальция (СаС1> ° 6Н О), затем добавляли к оставшимся в осадке протопластам жидкую среду Гамборга

Bg c D -маннитом и тремя фитогормона ми и высевали в чашки Петри (по

2 мл на чашку Петри 60-12 мл) . Финальная концентрация протопластов составляла 40000-60000 в 1 мл.

Через 5 — 6 недель из протопластов образовались клеточные колонии (более 32 клеток в каждой), которые после 2-3 недель инкубации íà агариэованной среде Гамборга В6 с

0,8 мг/л БАП и 0,4 мг/л ИУК образовывали небольшие каллусы (в среднем масса одного каллуса 200 мг). Последние инкубировали 2-3 недели на среде того же состава, которая применялась для получения каллусов из листочков, а затем помещали их на среду с 0,2 мг/л БАП.

Через 2-3 недели на каждом каллусе образовалось в среднем 2 зеленых эмбриоида, которые пересаживали на среду Гамборга В> без фитогормонов. По мере развития из эмбриоидов растений с двумя-тремя тройчатыми листьями и корнями их пересаживали в почву и выращивали в обычных условиях, где они цвели и образовали семена.

Использонание изобретения позволяет ускорить получение новых сортов и гибридов люцерны за счет трансформации (введения молекул ДНК в . протопласты и регенерации измененных растений), соматической гибридизации путем слияния изолированных протопластов и получения высокопродуктивных, устойчивых к неблагоприятным факторам среды, болезням и вредителям межвидовых и межродовых гибридов, трансгеноза — переноса генетической информации в изолированные протопласты с помощью бактерий и вирусов, генетической инженерии и конструиронания гибридов, в которых сочетаются органеллы, ядра и цитоплазма, полученные из различных форм растений.

Регенерация растений люцерны из протопластов открывает большие воэ—

743647 формула изобретения

Составитель Г.Бростюк

Редактор Е.Месропова Техред Е. Гаврилещко Корректор Г.Назарова

Заказ 4532/18 Тираж 700 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1130 35, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", г. ужгород, ул. Проектная, 4 можности для изучения тонких механизмов цитодифференцировкн, взаимодействия с патогенами и т.д.

1. Способ регенерации растений люцерны, включающий получение каллусов на агариэованной питательной среде и последующее культивирование их в условиях, способствующих образованию иэ них растений, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью получения регенерантов из протопластов для последующей генетической модификации растений, из каллусов листового происхождения выделяют протопласты и инкубируют в жидкой питательной среде Гамборга В с фитогормонами 18-24 ч в темноте, а затем

5-7 недель при освещенности 400600 лк с еженедельным добавлением свежей питательной среды без осмотика до образования многоклеточных колоний, которые переносят на агариэованную питательную среду Гамборга

Bg с фитогормонами, и после образования из них каллусов последни» пересаживают на среды, способствующие регенерации растений.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю шийся тем, что в жидкую пи-.àòåëüную среду Гамборга В6 в качестве осмотика вводят 85000-95000 мг/л

О-маннита, а в качестве фитогормонов 1,0-1,5 мг/л 2,4-0, 0;5-0,75 мг/л кинетина и 0,2-0,8 мг/л бенэиламинопурина.

3. Способ по п.1, î = л и ч а ю шийся тем, что в агаризованную среду Гамборга В в качестве фитогормонов вводят 0,6-1,0 мг/л бенэиламинопурина и 0,3-0,5 мг/л индолилi5 -3-уксусной кислоты.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. "Селекция и семеноводство", 1977, 9 11, с. 35-37.

2. 3 . Takebe, Т. Nagata. "Protop1astes et fusion de се!1uies somati

ques vejeta1es, Р 212, р. 175-188, Paris, 1973.

3. Авторское свидетельство СССР

Р 679190, кл. A 01 H 3/00, 1977 (прототип) .