Способ получения дегидрогеназ

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

<о763463 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 260578 (21) 2621686/28-13 с присоединением заявки ¹ 2653704/28-13 (23) Приоритет—

Опубликовано 150980., Бюллетень ¹ 34

Дата опубликования описания 150980 (51)м. «(л, С 12 D 13/10

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДf(577,15 (088,8) (72) Авторы изобретения

tO.A. Троценко, A. П, Соколов, С . В, Лучин и Н, В, Логинова

Институт биохимии и физиологии мик роорганизмов

AH СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕГИДРОГЕНАЭ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно, к способу получения дегидрогеназ микробиологическим путем. 5

Известен способ получения дегидрогеназ, предусматривающий культивирование бактерий рода Pseudomonas на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли, дезийтеграцию с последующей обработкой бесклеточного экстракта сульфатом стрептомицина, сульфатом аммония и очистку Ферментного препарата (1).

В качестве источника фермента используют бактерии Pseudomonas

mult1voraus, выращенные на среде с глюкозой. Вйход глюкозо-б-фосфат ди- 20 гидрогеназы ЗОЪ, активность 140 ед/мг белка, Известный способ 1тредполагает получение;только одной, а именно, глюкоэо-б-фосфат дегидрогеназы. 25

Недостатками известного способа являются невысокий выход Фермента и использование глюкозы в качестве субстрата для выращивания бактерий ° 3П

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта и удешевление ,его.

Указанная цель достигается тем, что в качестве продуцента используют штамм Pseudomonas oleovorans

52, выращенный на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода метанол или метиламин, а очистку ферментных препаратов проводят Фракционированием на сефадексе

G-150 и хроматографированием на

ДЭЛЕ-агарозе с получением фракций,содержащих глюкозо-б.-фосфат дегидрогеназу и 6-фосфоглюконат дегидрогеназу.

После хроматографии на ДЭАЭ-агарозе-.фракцию, содержащую 6-фосфоглюконат дегидрогеназу, дополнительно очищают. на колонке с фосфоцеллюлозой.

Способ осуществляют следующим образом.

Штамм Pseudomonas oleovorans 52 выращивают в течение 24 ч на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода 2-5% метанола или метиламина. Клетки отделяют, раз рушают с помощью ультразвукового дезинтегратора, белки экстрагируют буферным раствором. Белковый экстракт обра763463 батывают последовательно сульфатом стрептомицина и сульфатом аммония,Полученный ферментный препарат фракционируют на колонке с сефадексом

G-150. Фракцию, содержащую обе дегидрогенаэы, хроматографируют на Колонке с ДЭАЭ-агароэой для их разделения. Выход глюкозо-б-фосфат дегидрогеназы 35-40%, удельная активность

160-170 ед/мг белка, Фракцию, содержащую б-фосфоглюко- нат дегидрогеназу, полученную после хроматографирования на ДЭАЭ-агароэе, далее хроматографируют на колонке с фосфоцеллюлозой.

Выход б-фосфоглюконат дегидрогеназы 15-20%, удельная активность

15-17 ед/мг белка, Характеристика штамма Рзеийощопаэ

oleovorans 9 52, Штамм выделен из активного ила и хранится в коллекции культур микроорганизмов кафедры микробиологии биологического факультета МГу, Морфология и культуральные свойства.

Грамотрицательные подвижные палоч« ки с одним полярным жгутиком. Средний размер клеток 1,0-1,8 х

10,4-0,7 мкм, Колонии íà NIIA-округлые, гладкие, выпуклые,непрозрачные, белые; при старении приобретают цвет кофе с молоком,до 1 мм в диаметре, края ровные, структура однородная, легко снимаются с агара петлей. Культура обильно растет íà NIIA, на сусле-агаре и голодном а rape рос та не т .

Физ иол оги я и биохимические с войства.

Штамм 9 52 — облигатный аэроб, желатину не разжижает, молоко не пептонизирует; сероводород и аммиак при росте на МПБ не образует; нитраты восстанавливает до нитритов и далее до газообразных продуктов. Оптимальная . о температура для роста 25-27 С, опти. мальное значение рН 7,0-8,0.Штамм растет на средах с углеводородами (гексадекан) и спиртами (метанол, этанол, пропанол, н-бутанол, изобутанол и глицерин). Иэ органических кислот рост бактерий обеспечивают:. малат, сукцинат, пируват, цитрат, лактат, бенэоат, бутират, фумарат, гликолат; из углеводов" глюкоза, сахароза, фруктоэа, мальтоза, рамиоэа, галактоэа, ксилоза. Из одноуглеродных соединений Ps.oleovorans 9 52 наряду с метанолом использует метиламин, но не растет на средах с фоамальдегидом, формиатом, диметиламином и триметиламином, При росте на средах с метанолом,метиламином и другими субстратами образует большое количество полисахаридной слизи, Использованиее одноуглеродных соединений Рз.oleovorans 9 52 осуществляется посредством гексулоэофосфатного цикла (вариант Энтнера-Дудороиа) .

Пример 1.Pseudomonas oIeovorans 952 выращивают в ферментере с рабочим объемом 70 л на среде следующего состава,(r на 1 л среды):КН>РО42,0

NaCl Ор5; (NH) 04 2,0; MgSO4 0g 0251

FeSO4 0,01; метанол 5,0, рН средЫ доводят до 7,2 10Ъ-ным раствором NaOH.

Температура выращивания -30 С, скорость перемешивания - 600 об/мин, аэрация — 0,5 объема воздуха в минуту на 1 объем среды. После 24 ч культивирования клетки собирают на сепараторе ACI -3M, Все дальнейшие операции проводят при + 4 С. В качестве буферного раствора используют 20 мМ трис-НС1, рН 7,1 содержащий 2,5 мй

MgCI< и 10 " М дитиоэритритола (буфер

A) . Клетки (100 r) разрушают на уль траэвуковом дезинтеграторе MSE (20 кГц Зх1 мин), белки экстрагируют буфером A и освобождают от кле20 точных обломков и неразрушенных клеток центрифугированием (20000g, 40 мин) .

К экстракту добавляют сульфат стрептомицина до концентрации 1%, 75 центрифугируют (10000g, 20 мин) и осадок отбрасывают.

К супернатанту добавляют сульфат аммония до 50%-ного насыщения, Осадок отбрасывают ° . Ферменты осаждают, доводя концентрацию сульфата аммония до 60Ъ-ного насыщения, Осадок растворяют в минимальном объеме буфера А. Нерастворившийся осадок удаляют центрифугированием (20000g, 15 мин) . Раствор наносят на колонку с Сефадексом G-150 (250 мл) и элюируют ферменты буфером А. Фракции элюата, содержащие обе дегидрогеназы, наносят на колонку с ДЭАЭ-агарозой, Фракции злюата, содеркащие 6-фосфо40 глюконат дегидрогенаэу, диализуют против 0,05 М ацетного буфера, рН 5, 6, содержащего 10-"М дитиоэритритола и нано= ят на колонку (40 мл) с фосфоцеллюлозой, Фермент элюируют градиентом, концентрации NaC1 в -.oì же буфере (0-0,4 M) . Далее препарат концентрируют переосаждением сульфатом аммония или на колонке с

ДЭАЭ-агароэой.

K полученным препаратам для стабилизации ферментов прибавляют глице- уин до концентрации 50%, Выход глюкозо-6-фосфат дегидрогенаэы 40%, удельная активность

170 ед/мг. Выход 6-фосфоглюконат дегидрогеназы 20Ъ, удельная активность

17 ед/мг белка, П р и М е р 2.Способ осуществляют согласно примеру 1,но в качестве источника углерода используют 5 r/ë мещ тиламина.Выход ферментов и их удельная активность соответствуют полученным . в примере 1.

Описанный способ позволяет получить в одном процессе глюкозо-6-фосg5 фат дегидрогеназу и б-фосфоглюконат

763463

Формула изобретения

С ос таз и тель Т. Меле нтьев а

Редактор Г,Девятко Техред И.Асталош Корректор Г,Решетник

Эаказ 6234/25 Тираж 522 Подписи ое

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, X-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП Патент, г,ужгород, ул.Проектная, 4 дегидрогенаэу с хорошим выходом и высокой удельной активностью, а также использовать в качестве субстратов дешевое непищевое сырье взамен глюкозы.

1. Способ получения дегидрогеназ, предусматривающий культивирование бактерий рода Pseudomonas на питательной среде, содержащей источники углерода, азота фосфора и минеральные соли, дезинтеграцию с последующей. обработкой бесклеточного экстракта сульфатом стрептомицина, сульфатом аммония и очистку ферментного препарата, отличающийся тем, что, с целью повыаения выхода . целевого продукта и удешевления его, в качестве, продуцента используют штамм Pseudomonas oleovorans 52, выращенный на питательной среде,содержащей в качестве ис Жчника Углерода метанол или метиламин, а очистку ферментных препаратов проводят фракционированием на сефадекс

G-150 и хроматографированием на

ДЭАЕ-.агароэе с получением фракций, содержащих глюкоза-6-фосфат дегидрогенаэу и 6-фосфоглюконат дегидро!

О геназу °2. Способ по п.1, о т л и ч а ю шийся тем, что после хроматографии на ДЭАЕ-агароэе фракцию, содержащую 6-фосфоглюконат дегидрогеназу, дополнительно очищают на колонке с фосфоцеллюлозой.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Vander Wyk 7.С., Lessie Т.G.

The Journal of BaaterioIogy 120.

20 1033, 1974,