Способ определения состава изолированных клеток на гистологическом препарате

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Респу6лик

< >789747

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 250777 (2t) 2510437/28-13 с присоединением заявки Нов (23) Приоритет

Опубликовано 231280 Бюллетень И9 4 7 (51)М К 3

6 О! и 33/00

Государственный комитет

СССР ио делам изобретений н открытий (53) УДК 615.475 (088.8) Дата опубликования описания 23. 12. 80 (72) Авторы изобретения

Б.Н.Кудрявцев, М.В.Кудрявцева, Е.3.Завадская и Т.М.Шалахметова

Институт цитологии Академии наук СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТАВА ИЗОЛИРОВАННЫХ

КЛЕТОК НА ГИСТОЛОГИЧЕСКОМ ПРЕПАРАТЕ

Изобретение относится. к цитологии и может быть использовано в цитохимии для количественной оценки содержания компонентов клетки.

Известен способ определения состава изолированных клеток на гистологическом препарате путем введения меченого предшественника ДНК, скрашивания по Фельгену, нанесения фотоэмульсии, подсчета меченой ДНК и ее цитофотометрии )1).

Однако известный способ не позволяет точно определить состав изолирс ванных клеток на одном препарате.

Цель изобретения — повышение точности способа эа счет определения состава изолированных клеток на одном препарате. та цель достигается тем, что до опрашивания по Фельгену ставят PAS,реакцию и определяют содержание гликогена, после чего препарат обрабатывают 0,0204-0,025% борогидридом натрия в течение от 20 до 30 мин при температуре от 2 до 5оС.

Способ осуществляют следующим образом.

Вначале на предметном стекле приготавливают препарат-мазок изолированных клеток (например, для приготовления мазков изолированных клеток печени используют следующую методику: после декапитации животного печень. перфузируют в течение

5 10 минут смесью равных объемов фосфатного буфера (рН=8,0) и 5%-ro раствора сахароэы, измельченные кусочки печени помещают на 8 мин в фосфатный буфер (рН=7,3) и затем

I0 приготавливают мазки от животного, которому предварительно вводят меченый предшественник ДНК ЗН-тимидин (иэ расчета 1 микрокюри на грамм веса животного) и фиксируют его ме-. танолом. Затем на препарате выбирают неподвижные клетки на основе морфологических критериев и картируют препарат, т.е. замечают на нем положение каждой выбранной клетки

20 и нумеруют ее. После этого предметное стекло покрывают покровным, используя при этом в качестве заключающей среды глицерин, и измеряют сухой вес отмеченных клеток с по25 мощью интерференционнного микроскопа. Снимают покровное стекло, с помощью этанола удаляют глицерин, проводят "флуоресцентную" РА5-реакцию т.е. оксление клеток периодатом каgQ лия (0,8Ъ-ый раствор КIО на 0,3%-ой

78974 7

2 с 4 с 8 с

) н-т j j (Тип клетки

Ь

Н-Т

Ъ 3

+ Н-T — Н-Т

Н-Т

+ Н-Т

Параметр гликоген, усл. ед.

28,2

15,9

13,8

7,8 сухой вес, усл. ед.

194,2

103,5

90,2

48,1

Ь

Примечание: + Н-Т вЂ” клетки, включившие !-тимидин

- Н-Т - клетки, не включившие Н-тимидин

Формула изобретения азотной кислоте, рН=2, 2, температура комнатная, продолжительность окисления 90 мин) и окрашивание их затем реактивом типа Шиффа аурамином-SO (свежеприготовленный 0,3-ный водный раствор аурамина О + 0,2 мл хлористого тионила) в течение 90 мин при комнатной температуре (5-7 ), заключают препарат в вазелиновое масло и измеряют содержание гликогена в тех же клетках с помощью цитофлуориметра. Снимают покровное стекло, с помощью этанола или ксилола удаляют с препарата вазелиновое масло и обрабатывают его 0,025Ъ-ным водным раствором борогидрида натрия в течение 30 мин при температуре

2-5ОС. Такая обработка приводит к полному удалению положительной PASреакции в клетках и блокированию альдегидных групп гликогена, образовавшихся ранее при окислении препарата периодатом, содержание ДНК при этой обработке не затрагивается.

Споласкивают препарат в 3-х сменах дистиллированной воды (по 1 мин. в каждой), вновь фиксируют его метанолом и высушивают на воздухе. Окрашивают препарат на ДНК с помощью обычной или "флуоресцентной" реакции .Фельгена, т.е. проводят гидролиэ препарата в соляной кислоте (например бйНС! в течение 8-10 мин при комнатной температуре),окрашивают его соответственно обычным реактивом

Шиффа или реактивом типа Шиффа аураПредлагаемый способ обеспечивает высокую точность за .счет определения состава изолированных клеток на одном препарате, он позволяет исследовать заА номерности соотношения содержания гликогена . и сухого веса в популяциях различных типов клеток, в частности в клетках к раэличйой степени плоидности, клетках, находящихся на разных стадиях митотического цикла. Предлагаемый способ может быть использован не только в: теоретических работах, но и непосредственно в медицинской практике, где на диопсийном или хирургимином - S Q (свежеприготовленный

О, ЗЪ-ый водный раствор аурамина

О + 0,2 мл хлористого тионила,температуре 2,5ОС) в течение 90 мин, дифференцируют в сернистых водах и спиртах возрастающей крепости, высушивают на воздухе и заключают в вазелиновое масло. Содержание ДНК в отмеченных клетках, окрашенных с помощью обычной реакции Фельгена, измеряют на абсорбциойном цитофотометре, а окрашенных с помощью "флуоресцентной" реакции Фельгена на цитофлуориметре. Снимают покровное стекло, удаляют с препарата вазелиновое масло с помощью этанола или !

9 ксилола, обычным способом наносят фотоэмульсию на препарат, экспонируют его и затем определяют число зерен серебра над ядрами тех же клеток визуально или с помощью подходящей

Щ аппаратуры.

В результате проведения всех операций достигается точное определение в клетке каждого компонента. В качестве примера применения предлагаемого способа приводят результаты определения содержания гликогена и сухого веса в синтезирующих и несентеэирующих ДНК гепатоцитах крысы различной плоидности. Распределение клеток по содержанию ДНК следующее: диплоидные — 4,9%, тетраплоидные

85,8Ъ, октаплоидные — 9,3%. Данные сведены в таблицу. ческом материале можно исследовать соотношение содержания гликогена и сухого веса в клетках различной плоидности для диагностических це-. лей. При этом содержание гликогена и сухой вес могут быть измерены даже в популяциях, которые содержат

1-5 Ъ клеток с данной степенью плоидности.

Способ определения состава изо65 лированных клеток на гистологичес789747

Составитель С.Малютина

Редактор A.Судын Техред Е,Гаврилешко Корректор; Ю.Макаренко

Заказ 9025/38 Тираж 1019 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035,Москва,Ж-35,Раушская наб.,д.4/5

Филиал ППП "Патент".д. Ужгород,ул. Проектная,4 ком препарате путем введения меченого предшественника ДНК, скрашивания по Фельгену, Йанесения фотоэмульсии, подсчета меченой ДНК и ее цитофотометрии, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа эа счет определения состава изолированных клеток на одном препарате, до окрашивания по Фельгену ставят PAS-реакцию и определяют содержание гликогена,после чего препарат обрабатывают 0,020%0,025% борогидридом натрия в течение от 20 до 30 минут при температуре от 2 до 5 С.

Источники информации, 5 принятые во внимание при экспертизе

1. Папаян Г.В.,Агроскин Л.С., Бродский В.Я., Раутиан Л.П. Одновременное измерение количества вещества и интенсивности метки на окрашенных автографах. †"Цитология", 1973,15,9, с. 1184-1190.