Способ определения катехоламинов в биологической жидкости

 

Союз Советскик

Социалистическик

Республик

IttI 789752

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (б1) Дополнительное и авт. сеид-ву— (22) Заявлено 090278t (21) 2580122/23-04 с присоединением заявки Ио (23) Приоритет—

Опубликовано 231280, Бюллетень 47

Дата опубликования описания 2Ы280

<я}м. к .

G 01 и 33/50

Государственный комитет

СССР яо делам изобретений и открытий (53} УДК 54 3. 42. 0S2; (088.8) (72) Авторы изобретения

П.М.Аширов, Г.И.Лихтенштейн и С.П.Смотров г

Таджикский государственный университет иМ. В.И.Ленина. (71) За яв и тель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАТЕХОЛАМИНОВ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ

ЖИДКОСТИ

HH3С CHHз

1О Н3С Н Сн, 1

0 3 ЕН

Соон

0 г нс — с

iI N—

НС вЂ” С г \

СН сн ""3 ССНН3

0 нзс ц сн, 1

Снд СНЗ

Изобретение относится к анализу биологических объектов, преимущественно в диагностических и прогности ческих целях.

Известен способ определения катехоламинов в биологической жидкости, заключающийся в том, что к пробе биологической жидкости одновременно добавляют антисыворотку к определенному катехоламину и меченый катехол-: амин,инкубируют полученную смесь при 0-5 С в течение 18 ч, отделяют несвязавшийся меченый катехоламин с последующим определением радиоактивности связавшегося с антисывороткой меченого катехоламина (11 .

Недостатком известного способа является его длительность.

Цель изобретения — сокращение времени проведения анализа.

Указанная цель достигается тем, антисыворотку к определяемому катехоламину и меченый катехоламин предварительно смешивают, полученную смесь инкубируют и после добавления к ней пробы биологической жидкости смесь повторно инкубируют и снимают спектр электронного парамагнитного ,резонанса, причем в качестве меченого катехоламина используют катехоламин общей формулы

R где R " катехоламин, соответствующий

5 определяемому, о

При предварительном смешивании

25 антисыворотки и катехоламина с ковалентно присоединенным к нему свободно-радикальным соединением происходит полное связывание антисыворотки с меченым катехоламином. По3Q лученную смесь инкубируют в течение

789752

60

1 ч для полного взаимодействия ком1 понентов и затем добавляют к ней пробу вещества. Полученный состав повторно инкубируют в течение 30 мин при этом происходит конкурентное вытеснение определяемым катехоламином биологической жидкости эквивалентного количества меченого катехоламина, связанного с антисывороткой.

Вытесненный с поверхности молекул определенного класса белков (антисыворотки) меченый катехоламин, количество которого эквивалентно определяемому в биологической жидкости, подвергают, не отделяя от состава, спектральному анализу и по спектру

ЭПР определяют количество катехол- 15 амина в пробе вещества.

Приготовление специфических к катехоламину антител.

Получают конъюгат бычьего сывороточного альбумина (БСА) с норад- 20 реналином (HA) с помощью конъюгирующего реагента водорастворимого карбодиимида (ВКД). 1 r BCA растворяют в 10 мл дистиллированной воды. В раствор добавляют 1 г HA. К полученному раствору приливают 0,5 r метапара-толуолсульфонат-1-циклогексил3(2-морфолинил-4-этил)карбодиимида, растворенного в 5 мл воды. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре сутки. Затем проводят диалиэ в течение 3 сут против дистиллированной воды. 0,75 r полученного конъюгата растворяют в

30 мл .дистиллированной воды и добавляют 0,125 г фенола, 0,225 г

NaC1 и 7„5 мл геля Al(OH)q . 2,5 мл этой смеси вводят внутримышечно животным в два места раэ в неделю в течение шести недель. Через неделю после последней инъекции у кролика берут кровь. Наличие антител к гаптену в антисыворотке определяют иммунодиффузией в arape по методу Сухтерлони.

Получение спин-меченого норад45 реналина.

3,6 мг HA растворяют в 1 мл 0,05 Е .боратноГо буфера рН 9,0. В раствор вносят 17 мг иминоксильного радикала.

Смесь перемешивают б ч при комнатной температуре, затем добавляют 1 мг иатрийборгидрида и смесь перемешивают еще 2 ч. Раствор нейтрализуют

0,1 н. раствором HCl и освобождают от гнепрореагированного радикала гельфифтрацией через колонку с сефадек- 55 сом С-10, используя в качестве элюирующего раствора бидистиллированную воду. Степень очистки контролируют спектрофотометрически, методом ЭПР и с помощью тонкослойной хроматографии.

Получение спин-меченого комплекса гаптен-антитело.

В тонкостенную стеклянную ампулу вносят 10 мкл $-глобулиновой фрак- 65 ции сыворотки иммунизированного кролика и 10 мкл раствора спин-меченс

ro . норадреналина, содержащего

10 8 моль/л иминоксильного радикала, смешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Контроль за полнотой взаимодействия гаптенантитело проводят на ЭПР-спектрометре.

Построение калибровочной кривой

Градуировку производят по спинмеченому комплексу гаптен-антитело, содержащему известную концентрацию норадреналина. В 4 ампулы, содержащие по 20 мл раствора спин-меченого комплекса, добавляют по 30 мкл стандартного раствора норадреналина следующих концентраций: 0,1 мкг/мгг, 0,5 мкг/мл, 1,0 мкг/мл, 2,0 мкг/мл.

Растворы перемешивают и инкубируют в течение 30 мин. При последующем измерении на ЭПР-спектрометре снимают характеристики полученных спектров. Строят калибровочную кривую зависимости амплитуды полученного сигнала от концентрации норадреналина в стандартных растворах.

Пример 1. Количественное определение норадреналина в моче.

Пробу суточной мочи здорового человека концентрируют до объема

1 мл. В тонкостенную стеклянную ампулу вносят 10 мкл антисыворотки к .норадреналину и 10 глкл меченого норадреналина (10 И) с общей структурной формулой но

СН вЂ” СН вЂ” НН

"„",1.Х;„"

Полученную смесь инкубируют в термостате при 37 С в течение 1 ч.

Контроль за полнотой взаимодействия . компонентов проводят на ЭПР-спектрометре. После инкубации к смеси добавляют 30 мкл пробы концентрированной мочи и полученный состав повторно инкубируют в термостате при 25оC в течение 30 мин. Затем ампулу, содержащую вышеуказанный состав, помещают в резонатор ЭПР-спектрометра и снимают спектр. Измеряют характеристики спектра и определяют количественное содержание нерадреналина, используя при этом калибровочный график за-. висимости количественных характеристик спектра (отношение амплитуды второй компоненты спектра меченого норадреналина к амплитуде эталона—

Мп+1 ) от количественного содержания норадреналина в стандартных растворах. Содержание норадреналина в 1 мл концентрированной мочи испытуемого здорового человека, определенное предлагаемым способом, составляет

24,4 мкг.

789752

Результаты количественного определения других катехоламинов в моче здорового человека, полученные предлагаемым способом, приведены в таблица, Определение нужного катехоламина в в биологической жидкости предлагаемым

I способом занимает всего 1,5 ч, что значительно мвиыае времени определения известным способом (18 ч и дополнительная операция nb отделению избытка меченого катехоламина из состава) хо о ц щ х с

Ю

00 ()

f4 х х х .) э х а—

o u х х о о х

ОО1 дх.е ц п хнэыохк

Qх х х х

oeeoezX

QX4&rd

mb х н х цон

oem

Х Р (б

Х 1

ХЕ1 O нах х

Rock о эох

mыцхх

» х ц х х

Е Е ф

I ало

eО ц лоо о Йа

Ю

Г Ъ

1О. е41 до,ц и и о о эхх х э х

4)E х

E CtX й3 ох

& э

Ф

Ф Х х ао

4 н о х х

» э

Р Ф н э

vz п

Ц х х и э

» и н ю A

Ъ

A и ф Ц ъ

z х

"— *- с и-z х х -о . х х

> > — х

О >

1 х

U-О

789752 х а !

1 с1 т>=о

I х-

I, х

I х х )-О х

I х

I х х и»»о о о о х 1) Э

1 1)

I ъ -о о Р о "„, т.

789752

Формула изобретения

Нзс сн сн

N сн, сн

-«о

tO сион

СН

CH3 HL а 0) о гг

í — с

35 IHe C

Составитель С.Хованская

Редактор И.Михеева Техред М.Кузьма Корректор М. Демчик

9025/38 Тираж 1019 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035,Москва,Ж-35,Раушская наб.,д.4/5

Заказ

Филиал ППП "Патент",r.Óæãîðîä,ул.Проектная,4

Способ определения катехоламинов в биологической жидкости, путем добавления к пробе биологической жидкости антисыворотки к определяемому катехоламину и меченого катехол амина, инкубирования полученной смеси, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени анализа, антисыворотку к определяемому катехоламину и меченый катехоламин предварительно смешивают, полученную смесь инкубируют и после добавления к ней пробы биологической жидкости смесь повторно инкубируют и снимают спектр электронного парамагнитного резонанса, причем в качестве меченого катехоламина используют катехоламин общей формулы

R - Ml где R — катехоламин, соответствующий определяемому, h3 з снз

3. 0

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Grota U., Rvown G. Antibodlest

to CatechoIamines.-"Endocrinologyn

1976, 98,3,с.615,622 (прототип).