Способ получения оптически активных аминокислот

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный н патенту (22) Заявлено 09.07.76 (21) 2381854/28-1З (23) Приоритет (32) 10.07.75

<и 810082 (51) М. Кл.

С 12 P 13 04 гаеударстаееные хеиетет

СССР ее делам азебретенее а отлемтее (33) (31) 25252A/75

Опубликовано 2802.81, Бюллетень № 8

Дата опубликования описания 2802 81 (53) УДК 668.394 (088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Людвиг Деген (ФРГ), Аурелио Вилия, и Елена Перриконе (Италия) Иностранная фирма

"Хнаьшрогетти С. П. А." (Италия) r

Эудженф Фащеб

Ì4 тед.," 9 (71) Заявитель а

- (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОПТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ

DL-АМИНОКИСЛОТ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения оптически активных аминокислот.

Известен способ получения оптически активных аминокислот путем ферментативного пщролиза их производных, например фенилглицина или его производного, микроорганизмами.

Azotobacter f l ) .

Однако известный способ не предусматривает высокого выхода целевого продукта с не- 1О обходимой оптической чистотой, Цель изобретения — повышение выхода и удешевление 0(-аминокислот с повьппенной оптической чистотой целевого продукта. г

Поставленная цель достигается тем, что фер- )4 ментативный гидролиз гидантоиновых производных аминокислот осуществляют штаммами

Pseudomonas sp. 942 или 945.

Гидролиз производных аминокислот — гидантоинов осуществляют ферментами, образующимися во время роста микроорганизмов рода — Pseudomonas, причем фермент — энзим может употребляться непосредственно и виде бактериальной суспензии или среды с культурой, или же он может быть выделен 24 экстракцией из клеток и среды для культивирования.

Сущность способа заключается в следующем.

Бактериальные штаммы, вьщеленные иэ почвы, остатков растений различных видов . и т.д., а также штаммы, полученные из бактериальных коллекций, инокулируют с пластинок. в. колбы объемом 250 мл, содержащие 50 мл среды с рН 7,2 следующего состава, г/л:

Мясной пелтон 10

Экстракт дрожжей 10

Глюкоза 5

NaCI 3

5- (О, L)-метилпщантоин 1

Среду стерилизуют 30 мин при 110 С. Затем выдерживают 20 — 24 ч в термостате при перемешивании и температуре 30 С. Содержимое колбы объемом 500 мл, в которой находится 100 мл той же среды, выдерживают в термостате вместе с 5 мл описанной выше предварительно приготовленной культуры. После 18 — 22 ч дополнительной выдержки в термостате проводят энзиматическую реакцию с

Остаю»цимися клетками для чего в пробирку с 10 мл фосфатного буферного ра: твора

0,07 М, рП 8,5 с 20 мкмоль/мл 5- (О,» )-фенилгидантоина прибавляют l мл бактериальной суспензии (сухой вес сколо 50мг/I:úè)

После 30 мин выдержки в термостате нри о

30 C проводят реакцию с п-днметиламинбензальдегидом для количественного определения образов ав шегося карба мильного произв одного.

Используют штаммы Pseudornonas sp. 942 или 945, а также рчд других этого рода, полученные из Центрального бюро грибковых культур, где им присвоены символы СВ

14575 и 14б75 соответственно. Бактериальные штаммы (табл.l) хорои»о растут на всех обычных лабораторных средах, способны потреблять гидантоин в качестве единственного источника азота. Рост наолюдается при 5—

40 С, оптимальные пределы 26--30 C.

Штаммы классифицированы по генетическому принципу. Их характе*>истика представлена в табл. 2.

Гидролиз гидантоинов происходит не только в присутствии микроорганизмов или незатронутых их клеток, но также и в экстракТаХ ЭТИХ МИКРООРГаНИЗМОВ, КОТОРЫе МОГУТ быть культивированы, например, »» жидкой питательной среде для получения гидролазы в клетках и DL-гидантсины могут быть после этого прибавлены к культуре. Энзиматическая ферментативная реакция может быть также проведена в отсутств»ги тэк называе-. мых "покоящихся" клеток. В "ro:,» .; —.:."-л:с бактериальные клетки выделяют из культуральной среды, г»ромывьчот и суспендируют в забуференной среде, к которой прибавлен рацемический гидантоин. Могут быть использованы также препараты, содержащие гидролазы, такие как экстракты или концентрать, сырые или очищенные препараты гидролазь,, полученные из клеток микроорганизмов (табл. 1). Можно испоЛьзовать также иммобилизованные ферменты.

Пример 1. К 100 мл бульонной культуры в среде штамма Pseudomonas sp. 942 в колбе объемом 500 мл прибавляют í=

24 ч выдержки в термостате (псремешивание вращением) при 30 С 100 мл фосфатпого буферного раствора (0,14 М) с рН 8,,5, который содержал, 30 мкмоль, мл 5-(D,l )-фенилгидантоина. После 5 ч выдержки в термостате в тех же условиях определяют образовавшийся N-карбомилфенилглицин. Из 530 мг

5-(0 1)-фенилгидантоина получают 525 мг

N-карбамилфенилг»тицина, что соответствует примерно 90%-ному выходу.

Пример 2. К бульонной культуре, которая приготовлена с описанным выше составом, прибавляют 1 г/л 5.ЯЯ.)-метилгиданПример 3. Готовят среду щего состава:

Двузамещеннь»й фосфат натрия

Иа НРО„г/л

Двузамещенный фосфат

КН2 PO4 »/л

Сульфат аммония (МН4) 2 SO4 г/л

Сул»>фат магния

IgSO4, r/ë

Сульфат двухвалентного марганца МпЯС» . г/мл

FeSO4 . 7II2 О, г/мл ! люкоза, г/л

Экстракт дрожжей, г/л

5- И,о -Ме:.Нлгидантоин г/л следую7;5

2,72

5,0

0,2

0,45

5,5

0,2

Среду разливают по 50 мл в колбы объемом 250 мл и по 100 мл в колбы объемом

500 мл, стерилизуют 30 мин при 110 С. Со5О держимое колб инокулируют срезом с пластин, на которых находится культура»дтамма

Pseudomonas sp. 942 и выдерживают в термостате, 24 ч при 30 С. Из этой культуры (оптическая плотность при длине волны 550 нм

0,245; степень разбавления 1:10) инокулируют 5 мл в колбы объемом 500 мл. После выдержки 19 ч в термостате при 30 С получают "покоящиеся клетки.

4 тонн. pi. устанавливают на уровне 7,2 добавi ;a2 ÑO, и среду распределяют по 50 мл в колбы объемом 250 мл. После 30 мин стерилизации при 110 С содержимое колб инокулируют культурой Pseudonlonas sp. 942 с пластинки, которая содержит ту же среду вместе с 2% агар-агара (* Difco") и выдерживают в термостате ?О ч при температуре

30 С и перемешивании вращением (220 об/мин, 1

С помощью предварительно приготовленной культуры (оптическая плотность при 550 нм

0,400; степень разбавления 1:10) инокулируют 5 мл в колбах объемом 500 мл, которые содержа- 100 мл той же среды и выдерживалгт в термостате при 30 С и перемешивании 8 .: (последняя фаза экспоненциального poc-.."à.), После. этого клетки собирают путем центрнфугирования и промь»вают 3 порциями эабуфере»пн>го физиологического раствора, суспен,,-»ру»от в буферном растворе соли-фосфат;l,, 0.,074 М, рН 8.,5 (" покоящиеся" клетки). !!ля проведения ферментгтивного (энзиматического) гпдролиза в колбах объемом 250 мл о выдерживают в термостате при 30 С и перемешивании б4 мл бактерий (сухой вес) и

20 мкмоль/ill 5-(D,I )-фенилгидантоина (3,52 мг/мл). Че»>ез различные промежутки времени,одукт гидролиэа, т.e. D-карба.:::. „: лицин, определяют калориметриметодом при длине волны 438 нм. о

8100

Пример 4. Бактериальные клетки ro- 1п товят из штамма Pseudomonas sp. 942 аналогично примеру 2. Суспензию клеток 42 мг/мл (иэ расчета на вес сухих бактерий) в буферном растворе соли-фосфата 0,1 М, рН 8, подвергают механическому .разрушению в гомогенизаторе "Maíò — Гаулин" под давлением .

850 кг/см и температуре ниже 24 С. Экстракт отделяют центрифугированием. К 950 мл фосфатного буферного раствора (рН 7,7), содержащего 2,12 г 5-(0,1)-фенилгидантонна нриТаблица 1 ннлглицин, % о выхода

940

Pseudomonas sp.

941

942

943

944

945

946

947

948

949

950-955

Pseudomonas

fluorescens

956

-41

Pseudomonas sp.

Pseudomonas АТСС

957

11299

Pseudo monas о! ео огans С1. 59

Ферментативный гидролиз проводят при

30 С в реакционной среде, содержащей 64 мл буфера, 280 мг бактерий (из расчета на су хой вес) и 20 мкмоль/мл 5-(0,1 )-фенилгидантоина. Через 5,10 и 15 мин определяют 5 количество образовавшегося карбамильного производного, которые составляют 1,15; 2,05 и

3,00 соответственно.

82 6 оавляют 50 мл экстракта, содержащего

8500 ед. фермента, выдерживают 1 ч при

30 С. Получают 1,7 г; О-карбамильного производного (80% от теории).

Пример 5. Аналогично примеру 4, к

993 мл субстрата прибавляют 7 мл экстракта, который предварительно подвергают семикратной чистке, Через 1 ч при 30 С образовывается

1,7 r О-карбамильного производного (примерно 80% от теории).

Пример 6. Аналогично примеру 2, получают после 30 мин выдержки при 30 С со ппаммом Pseudomonas sp. 945 и 352 мг

5-(D,L)-фенилгидантоина 220 мг карбамилфенилглицина (примерно 57% от теории).

Предлагаемьй способ обеспечивает получение 0-аминокислот в промышленном масшта.бе, снижение затрат на их производство, а также увеличение выхода продукта с повышенной оптической чистотой.

810082

8859

11250

Таблица 2

Характеристика

nas sp. 945

0,6-1 0

2,5 — 4,5

0,6 — 0,9

2 — 3,5

Предконцевое

Предконцевое

Форма спор

Эллин сои дная

Эллин сондная

50 — 55

30

Индол

Уреаэа

Рост в хлориде натрия 2%-ном

3%-ном

5%-ном

Катала за

Анаэробиоз

Pseudomonas

desmolyt icum NCIB

Pseudomonas

f luoroscens АТСС

Pseudomonas putida АТСС 12633

Ширина

Длина

Реакция Грама

Подвижность

Па ожение спор

Набухание спорангий

Максимальная температура роста, С

Минимальная температура роста, С

Гидролиэ крахмала

Жела тины

Отношение к нитратам и нитрнтам (NO>PIO>) Щелочная реакция в У вЂ” P бульоне

Продолжение табл. 1

Составитель М. Ларина

Техред Ж. Кастелевич

Редактор Б. Дичинская

Корректор Г. Назарова

Тираж 539

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 492/85

Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Формула иэобрeòåíèÿ

Отособ получения оптически активных 0L-аминокислот путем ферментативного гидролиза гидантоииовых производных, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения выхода и удешевления целевого продукта, фермента810082 10 тивный гидролиэ гндантоиновых производных аминокислот осуществляют штаммами Pseudo—

monas sp. 942 или 945.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Японии N4 45-8635, кл. С 12 0 13/16, опублик. 1970.