Способ количественного определенияактивности тимозина

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОВРИТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Соеов Советеиик

Сецнвинетичесинк рееву)елин (!) 824051 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22)Заявлено 04.05.78 (21) 2612562/28-13 с присоединением заявки М (23) Приормтет—

Опубликовано 23.04.81. Бюллетень М 15 (51)М. Кл.

Ñ Ol Й 33/54

Имудеуетеаивй кеивтет

Ссср ю делен веебретевнй н етеентвй (53) УДК 615. .36 1 (088.8) Дата опубликованмя описамия 25.04.81 (72) Авторы изобретения

Э. В. Гюллинг, М. Б. Самбур и Г. П. Крав

1 4,@Отца ст

Киевский научно-исследовательский институт отоларингопогии (71) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

АКТИВНОСТИ ТИМОЗИНА

Изобретение относится к медицине, а конкретно к способам определения активности тимоэина - гормона, выделяемого из вилочковой железы и применяемого в эксперименте и клинике для лечения больных с иммунодефицитными и аллергичесS кими заболеваниями.

Наиболее близким к предлагаемому является способ 1, р. В О в h, включающий удаление тимуса, получение лимфоцитов 0 иэ селезенки оперированных мышей, инкубацию их с тимозином, с .антилимфоциi. тарной сывороткой или азатиоприном, инкубацию с эритроцитами барана и подсчет спонтанных,: розеткообраэукецих клвток (РОК) Я. Об активностR препарата судят по его минимальному количеству, уменьшающему число РОК на 50%. Однако применение этого способа требует проведения технически сложной операции, сопровождающейся гибелью 3.050% животных, дорогостоящих аэатиоприна или антилимфоцнтарной сыворотки, получение которой является трудоемким

2 и длительным процессом. Кроме того, на подсчет розеткообразующнх лимфоци- . тов у мышей по способу t.V ВасЬ затрачивается много времени, так как количество таких клеток очень мало (110 íà 10000 лимфоцитов); На одно определение необходимо как минимум одно животное. Спонтанные розетки являются нестойкими, что снижает точность способа.

Цель изобретения — ускорение и упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе количественного определения активности тимоэина путем инкубации лимфоцитов в присутствии тимознна с последующим отделением взвеси лимфоцитов, повторной инкубацией их с эритроцитами другого организма и подсчетом числа розеткообразующих клеток, используют лимфоциты тимуса морской свинки и эритроциты кролика, 1 при этом взвесь лимфоцитов, включающую 10 - 2 10 клеток в 1 мл пита6, 6

Способ количественного определения

zs активности тимозина путем инкубапии лимфоцитов в присутствии тимоэина с последующим отделением взвеси лимфоцитов, повторной инкубапией их с эритроцитами другого организма и подсчетом числа po-, gp эеткообразующих клеток, о т л и ч а юm и и с я тем, что, с цельк> ускорения . и упрощения способа, используют лимфоциты тимус& морской сВинки и BpHTpollHты кролика, при этом взвесь лимфоцитов, включающую lO — 2 l0 клеток в 1 .мл

6 Ь

35 пи ательной среды, прогревают перед инкубацией с тимозином при 44,5-45,5 С в течение 55 65 мнн, а активность тимоэина определяют по минимальному его количеству, увеличивающему число

40 роэеткообразуюших клеток на 50-1009о.

Источники информации, принятые во внимание пря экспертизе

1.Boch,ÞÓ.,Dài äånnå М., Aritigen

Recognition Ь Т-Lqrnphocgtee. Б щ 1аг

Fkfects ok АтаЮ1оргine, ALS and Anti

Thgrnedomized М се",-Се@ Jrnrnunog.

Nr 3, 3. 1. l972.

3 82405 тельной среды, прогревают перед инкубацизй с тимозином при 44,5-45,5 С в течение 55-65 мин, а активность тимозина определяют по минимадьному его количеству, увеличивающему число .ро- - . ,зеткообразующих клеток на 50«100%.

Йа фиг. 3. изображена активность тимозина, определяемая настоящим способом; на фиг. 2 — активность тимоэина, определяемая известным способом. r 0

Способ осуществляется следующим образом.

Получают лимфоциты морской свинки и эритроциты кролика. Прогревают лимфоциты тимуса морской свинки, что приводит к утрате ими способности образовы-вать спонтанные розетки с эритроцитами кролика. Восстанавливают розеткообразующую способность лимфоцитов пум инкубации их с раэлич"ыми ко"ичест" го вами тимоэина. Инкубируют лимфоциты с эритроцитами кролика и определяют число образовавшихся розеток.

Пример. Морская свинка весом

200-300 г подвергается тимэктомии под этаыинал- натриевым наркозом . Вьщеленный тимус помещают в среду 199 или раствор Хэнкса, измельчают препаровальными иглами, фильтру1от через нейлоновый фильтр. Полученную взвесь лимфоцитов тимуса доводят до конечной концентрации 10 жизнеспособных клеток в 1 мл питателЬиой среды. Йля одного определения берут l мл указанной клеточной взвеси. Затем лимфоциты выдерживают 1 ч нри 45 С, дважды отО мывают питательной средой путем центрифугирования при 3.000 об/мин в тече.- ние 5 мин.. Отмытые клетки инкубируют

l ч при 37 С с различными количестваО ми тимоэина. Контролем служат прогрео тые лимфоциты; инкубируемые при 37 С

1 ч с питательной. средой. Затем лимфоциты дважды отмывают от тимозийа средой центрифугирсванием при 1000 об/мин в течение 5 мин добавляют к ним

30 ° 106 эритроцитов кролика, выдерживают L ч при 37 С, центрифугируют при

1.000 об/мин 5 мин и оставляют на о ночь при 4 C. На следующий день клетки осторожно ресуспендируют пипеткой 0

Пастера и подсчитывают число розетко3. 4 образующих лимфоцнтов под микроскопом в камере Горяева. Розеткой считают образование иэ лимфоцита трех нли более присоединившихся к нему эритропитов.

Об активности тимозина судят по минимальному его количеству, вызывающему увеличение числа. йанные об активности тимоэина, полученные настоящим способом, корре« . лируют с данными, полученными известным.способом (фиг. l и 2).

Предлагаемый способ позволяет ускорить и упростить определение активности тимозина. Способ доступен для широкого использования в лабораторной практике.

Лимфоцитов, выделенных из тимуса одной лишь морской свинки, стоимость которой

3 руб. 40 коп., достаточно. для проведения одновременно 80-90 анализов.

Формула, изобретения

82405 1

62.5 115 gf6

1000

Количестбо тимозина 6 миг /мл фиг.1

Составитель О. Ленчицкая

Редактор A. Шандор Техред С.Мигунова Корректор В, Сииипкаи

Заказ 2098/63 Тираж 907 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений .и открытий

113035,. Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Ф

И

М

О ь

4Þ !

70 о N ъ SO в lpga ф ф 30 гю

1О 56 1ОП

Количеетбо яимозииа д мкг/ми

Фиг.8

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектнаи, 4