Способ получения суммарного гистонаиз животного сырья

 

Союз Советских

< ) 843935

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 17.12.79 (21) 2854720/60-15 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (43) Опубликовано 07.07.81. Б|оллетень № 25 (45) Дата опубликования описания 07.07.81 (51) М. К

А 01 N 63/00

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 647.962.2 (088.8) ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. А. А. Жданова (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУММАРНОГО

ГИСТОНА ИЗ ЖИВОТНОГО СЫРЪЯ

Изобретение относится к области молекулярной биологии, в частности к способам получения комплекса хромосомальных основных белков-гистонов (суммарный гистон). Гистоны используются в модельных экспериментах прн исследовании механизма взаимодействия этих белков с дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) в дезоксирибонуклеопротеидном комплексе (ДНП) или в хроматине ядер тканей животных и растений, т. е. с целью изучения структуры хроматина, что является одной из основных проблем современной молекулярной биологии при изучении физико-химических основ жизни.

Гистоны — ядерные белки основного характера, которые асоциированы с дезоксирибонуклеиновой кислотой и негистоновыми белками в составе хроматина ядер клеток животных и растений. В настоящее время описано несколько способов выделения гистонов.

Известен прямой способ выделения хроматина из лизата клеток тимуса телят, который является первой ступенью в способе получения гистонов ll). Известно (21 усовершенствование указанного способа, но авторы не приводят данных по извлечению гистонов из хроматина.

Описан прием экстракции гистонов

0,25 н. HC(из хроматина с последующим диализом экстракта против воды и течение

2 — 3 сут и его лиофилизацпей (3).

Известен способ, взятый в качестве прототипа и заключающийся в следующем (41.

10 r замороженной печени, разрезают и гомогенизируют с 200 мл 0,075 М ХаС1 +

0,024 М Na> ЭДТА (этилендиаминотетрауксусная кислота) + 2-октиловый спирт в

1р течение 1 мин при 16000 об/мин и 4мин при

8000 об/мин. Гомогенат (около 250 мл) фильтруют через 2 слоя марли и через

2 слоя капроновой ткани. Затем смесь центрифугируют при 1500 об/мин в течение

15 15 мин, При центрифугировании осаждается хроматин. Осадок хроматина промывают 100 мл 0,075 М NaC1 + 0,024 М Na2

ЭДТА + 2-октиловый спирт и центрифугируют. Осадок хроматина три раза промывают 0 05 М трис-буфером; рН 8, следующими объемами — 80, 40 и 40 мл, Каждый раз осадок гомогенизируют и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин. Выход хроматина составляет 50% (по дезоксири25 бонуклеиновой кислоте). Осадок хроматина суспендируют в 30 мл 0,05 М трис-буфере, рН 8. По 5 мл суспензии наслаивают на

25 мл 1,7 М раствор сахарозы (раствор сахарозы приготовлен на 0,01 М трис-буфере, рН 8) и центрифугируют при 7000 об/мин

843915

3 ч. Выход хроматина составляет 70!о (по дезоксирибонуклеиновой кислоте). Осадок хроматина суспендируют в 0,01 М трис-буфере, рН 3, и диализируют против того же буфера в течение 18 ч. После диализа оса joK хроматина растворяют в 10 обьемах

0,015 М NaCI + 0,001 M натрий линоннокислый. Нерастворившиеся частицы удаляют центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 мин. К полученному раствору добавляют 1/4 обьема 1 и. Н SO4, перемешивают в течение 30 мин и центрифугируIoT 20 мин при 1200 об/мин. Экстракт сохраняют. Осадок после центрифугирования повторно обрабатывают уже 0,4 í. H2SO4 (1/4 объема) и экстракты объединяют, К объединенным экстрактам добавляют 4 объема охлажденного абсолютного этанола. Смесь выдерживают 24 ч при — 10 С.

Выпадает осадок суммарного гистона. Осадок собирают центрифугированием при

2000 об/мин в течение 20 мин, суспендируют в абсолютном этаноле и цептрифугируют при 10000 об/мин. Промывание осадка этанолом повторяют еще два раза, после чего его высушивают. Препарат суммарного гистона, полученный этим способом, характеризуется следующими показателями: содержание белка 90 /о, примеси негнстоновых белков 10 /о, содержание фракции аргипинбогатых до 30 — 50%, бактерицидная активность гистонов не исследовалось.

Указанный способ имеет следующие недостатки:

Конечный продукт имеет недостаточную чистоту — до 10 /о негистоповых примесей; в нем отсутствуют определенные фракции гистонов (аргинипбогатые) из-за их агрегации с примесными негистоновыми белками, неполноты осаждения из раствора при использовании этанола.

Осаждение суммарного гистона нз KIIcлотного экстракта этанолом не обеспечивает выделение фракций аргининбогатых гнстонов, в состав которых входит значительное количество неполярных аминокислот, в силу чего они находятся в растворимом состоянии в этаноле.

Бактерицидная активность в суммарном препарате сниженная за счет отсутствия фракций аргининбогатых гистонов.

Целью изобретения является повышение чистоты, выхода и сохранение бактерицидной активности конечного продукта.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе получения суммарного гистона из животного сырья, включающем гомогенизацию в буферном растворе при рН 8, осаждение и промывку хроматина, экстракцию и осаждение гистона, в раствор гомогенизации вводят лимоннокислый натрий и бисульфит натрия, экстракцию суммарного гистона проводят непосредственно из осадка хроматина, а оса>кдение осуществляют ацетоном в течение 0,5 — 1,0 часа при

4 температуре +4 Ñ, причем объемное соотношение экстракта и ацетона равно

1: 7 — 10.

Изобретение обеспечивает содержание белка не менее 98 /о, содержание примеси негистоновых белков 1 — 2 /о, содержание фракций аргининбогатых гистонов 80—

95 ооо

Бактерицидная активность сохраняется

1 мг суммарного гистона на 1 мл бактериальной суспензии.

Обеспечение чистоты препарата суммарного гистона, т. е. исключение содержания в нем негистоновых белков, достигает 5 ся экстракцией суммарного гистона непосредственно из осадка хроматина.

Хроматин ядер клеток животных представляет дезоксирибонуклеопротеидный комплекс (ДНП) с рибонуклеиновой кисло2о той, с двумя классами белков: белки основного характера — гистоны, на долю последних приходится 70 — 80"/О от общего количества белков хроматина и кислые белки— ядерные ферменты.

Известно, что при растворении хроматина в растворах низкой ионной силы нарушастся пространственная структура ДНП и при этом гистоны могут формировать комплексы с негистоновыми белками. При IIocледующем извлечении гистонов из раствора хроматина негистоновые белки могут соэкстрагироваться с гистонами и тем самым загрязнять конечный продукт.

Прием экстракции суммарного гистона непосредственно из осадка хроматина обеспечивает полную и избирательную экстракцию гистонов и позволяет избежать загрязпения препарата негистоновыми белками, так как последние остаются связанными с

Для обеспечения максимального выхода суммарного гистона, содержащего все пять фракций гистона, в предлагаемом способе в раствор при гомогенизации ткани вводят

45 натрий бисульфит и натрий лимоннокислый для ингибирования протеиназ, что исключаст протеолиз фракций гистонов Hl и Н4.

Выход полноценного конечного продукта, содержащего все пять фракций гистонов

5О (Hl, Н2А, Н2В, НЗ, Н4) в эквимолярном соотношении (20 /О по весу) достигается использованием высоких объемов ацетона (при объемном соотношении экстракта и ацетона 1: 7 — 10), а так>ке проведением

55 процесса осаждения при +4 С в течение

0,5 — 1 ч, так как в данных условиях все фракции гистонов находится в нативной аформе в нерастворимом состоянии.

Получение суммарного препарата, со60 держащего пять фракций гистона, обеспечивает его высокую бактерицидную активность в отношении Е. со11. Положительный эффект наблюдается при добавлении 1 мг суммарного гистона на 1 мл бактериальной

55 суспензии.

843915

49

5

Таким образом, предлагаемый способ заключается в следующем.

Свежезамороженный тимус телят измельчают на мясорубке и по порциям гомогенизируют с буферным раствором рН 8, содержащим 0,14 М натрия хлористого, 0,05 Mнатрия бису:льфата и 0,,01 М натрия л и монн окисл ого.

Гомогенат фильтруют через два слоя марли, через четыре слоя марли, потом через восемь слоев марли. Фильтрат центрифугируют. Осадок собирают и промывают буферным раствором рН 8. Осадок гомогенизируют с 0,4 н. серной кислотой и выпер>кивают при +4 С 10 — 12 ч.

Экстракт отделяют центрифугированисм и фильтруют.

К экстракту прибавляют охла:кденный, подкисленный ацетон в объемных соотношении экстракта и ацетона 1: 7 — 10 и выдерживают 0,5 — 1 ч при +4 С.

Осадок суммарного гистона собирают

Iа фильтре, промывают ацетоном и высушивают.

Содер>кание белка не менее 98"/о.

Чистота по электрофрезу на ПАГЭ: содержит все пять фракций; примеси негистоновых белков до 1 — 2О/.

Бактерицидная активность — 1 мг суммарного гистона на 1 м,ч бактериальной суспензии.

Пример 1. 2 кг свежезамороженного тимуса телят измельчают на мясорубке и измельченную массу по порциям -.îûîãåíèзируют с 10 л раствора, содержащего

0,14 Мнатрия хлористого,,0,05 М натрия бисульфпта и 0,01 М натрия лимонпокислог0, рН 8.

Гомогенат фильтруют через два, через четыре и потом через восемь слоев марли.

Фильтрат центрифугируют при 1500

n6/мин в течение 15 мин при 0 — 4 С.

Осадок собирают и заливают 4 л раствора, содержащего 0,14 М натрия хлористогп, 0,05 М натрия бисульфита и 0,01 М натрия лимоннокислого, рН 8, Смесь центр ифугир у ют пр и 1500 об/м и и в течение 15 мин, температура 0 — 4 С.

Осадок собирают и измеряют его обьем.

Осадок суспендируют в 4 л 0,4 н. раствор серной кислоты и по порциям гомогенизируют.

Гомогенизированную смесь оставляют экстрагироваться при 0 — 4 С в течении

10 — 12 ч.

После экстрагирования смесь центрифугируют при 2500 об/мин в течение 15 мин, температура 0 — 4 С.

Надослдочную жидкость собирают и фильтруют через слой ваты и марли. К фильтрату при перемешивании приливают

7 объемов охлажденного подкисленного ацетона (1 мл конц. II2SO4 на 2 л ацетона).

Суспензию выдерживают при +4 Ñ 1 ч.

Осадок гистона суммарного оседает на

6 дно сосуда. Надосадочный слой сливают.

Осадок двухкратно промывают неподкисленным ацетоном, cooHpBK)T, фильтруя суспензию через стеклоткань. Отф.1льтрованный осадок высушивают на воздухе до исчезновения запаха ацетона, потом сушат в вакуумэксикаторе над едким кали.

Выход: 20 г гистона суммарного; содержание белка 1007о; чистота по электрофорезу в полиакриламидном геле: содержит все пять фракций примеси негистоновых белков — следы.

Бактерицидная активность — 1 мл суммарного гистона на 1 мл бактериальной суспензии.

Пример 2. 1,8 кг свежезамороженного тимуса телят измельчаюч на мясорубке и измельченную массу по порциям гомогенизируют с 9 л раствора, содержащего 0,14 М натрия хлористого, 0,05 М натрия бисульфита, 0,01 М натрия лимоннокислого, рН 8.

Гомогенат фильтруют через два, через четыре и через восемь слоев марли.

Фильтрат центрифугируют при 1500 об/м>ш в тсчсппс 15 мпн, температура

0 — 4 С.

Осадок собирают и заливают 3,5 л раствора, содержащего 0,14 М натрия хлористого, 0,05 M натрия бисульфпта, 0,01 M натрия лимоннокислого рН 8.

Смесь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин, температура 0 — 4 С.

Осадок собирают и измеряют его объем.

Осадок суспендируют в 3,5 л 0,4 и. раствора серпой кислоты и по порциям гомогенизируют.

Гомогенизированную смесь оставляют экстрагироваться при 0 — 4 С, в течение

10 — 12 ч. После экстрагирования смесь центрифугируют при 2500 об/мин в течение

15 мин, температура 0 — 4 С.

Надосадочную жидкость собирают и фильтруют через слой ваты и марли. К фнльтрату при перемешивании приливают

10 объемов охлажденного, подкисленного ацетона (1 мл конц. НБО, на 2 л ацетона).

Суспензию выдерживают при +4 С 0,5 ч.

Осадок гистона суммарного оседает на дно сосуда. Надосадочный слой сливают.

Осадок двухкратно промывают неподкисленным ацетоном, собирают, фильтруя суспензию через стеклоткань.

Отфильтрованный осадок высушивают на воздухе до исчезновения запаха ацетона, потом сушат в вакуум-эксикаторе над едким качи

Вывод: 20 г гистона суммарного; содержание белка 99,5%; чистота по электрофорезу в полиакриламидном геле: содержит все пять фракций, примеси негнстоновых белков — следы.

Бактерицидная активность — 1 мг суммарного гистона па 1 мл бактериальной суспензии.

843915

Составитель М. Дранишников

Текред И. Заболотнова

Корректор Н. Федорова

Редактор Е. Хорина

Заказ 4600

Подписное

Изд. 433 Тираж 712

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Загорская типография Упрполиграфиздата Мособлисполкома

Пример 3. 2 кг свежезамороженного тимуса телят измельчают на мясорубке и измельченную массу по порциям гомогенизируют с 10 л раствора, содержащего

0,14 М ннааттрриия я ххллооррииссттооггоо, 0,05 М натрия бисульфита и 0,01 M натрия лимоннокислого, рН 8.

Гомогенат фильтруют через два, через четыре и потом через восемь слоев марли.

Фильтрат центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин, температура

0 — 4 С.

Осадок собирают и заливают 4 л раствора, содержащего 0,14 М натрия хлористого, 0,05 M натрия бисульфита, 0,01 M натрия лимоннокислого, рН 8.

Смесь центрифугируют при 1500 об/мин, в течение 15 мин, температура 0 — 4 С.

Осадок собирают и измеряют его объем.

Осадок суспендируют в 4 л 0,4 н. серной кислоты и по порциям гомогенизируют.

Гомогенизированную смесь оставляют экстрагироваться при 0 — 4 С в течение 10—

12 ч. После экстрагирования смесь центрифугируют при 2500 об/мин в течение 15 мин, температура 0 — 4 C. Надосадочную жидкость собирают и фильтруют через слой ваты и марли.

К фильтрату при перемешивании приливают 9 объемов охлажденного подкисленного ацетона (1 мг конц. НяЯО.г на 2 л ацетона).

Суспензию выдерживают при температуре 4 С в течение 45 мин.

Осадок гистона суммарного оседает на дно сосуда. Надосадочный слой сливают.

Осадок двухкратно промывают неподкисленным ацетоном, собирают, фильтруя суспензию через стеклоткань.

Отфильтрованный осадок высушиваюг на воздухе до исчезновения запаха ацетона, потом сушат в вакуум-сушильном эксикаторе над едким кали.

Выход 20 г гистона суммарного; содержание белка 98 /о; чистота по электрофорезу на ПАГЭ: содержит все пять фракций; примеси негистоновых белков 0,5 /О.

Бактерицидная активность — 1 мг суммарного гистона на 1 мл бактериальной суопензии.

Технико-экономический эффект изобретения заключается в выделении суммарно8 го гистона высокого качества: не содержащего негистоновых примесей, обладающего хорошей растворимостью, содержащего все пять фракций и обладающего бактерицидной активностью.

Таким образом, получение высококачественного препарата суммарного гистона обеспечит его применение в научных исследованиях в области молекулярной биологии

10 (изучение структуры хроматинов в модельных опытах), в препаративной биохимии (получение отдельных фракций), как субстрата при ферментативных реакциях (опыты по ацетилированию и фосфорилированию гистонов), при исследованиях антибактериальных и антивирусных свойств и в практической медицине (при лечении ряда кожных заболеваний). Способ легко осуществим в промышленных условиях и по сравнению с известным способом дает экономию

3000 руб. на 1 кг продукта и обеспечивает экономию сырья, материалов и рабочего времени.

25 Формула изобретения

Способ получения суммарного гистона из животного сырья, включающий гомогенизацию в буферном растворе при рН 8, 30 осаждение и промывку хроматина, экстракцию и осаждение гистона, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения чистоты, выхода и сохранения бактерицидной активности конечного продукта, в раствор гомо35 генизации вводят лимоннокислый натрий и бисульфит натрия, экстракцию суммарного гистона проводят непосредственно из осадка хроматина, а осаждение осуществляют ацетоном в течение 0,5 — 1,0 ч при 4 С, при

40 чем объемное соотношение экстракта и ацетона равно 1: 7 — 10.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

4, 5, 1. G. Molec. Biology, ч, 1, р. 1 — 20, 1959.

2. Methods in Cell. Biology, v. 17, ch. 3. р, 27 — 50, 1978.

3. Methods in Enzymology, v. 12. part. В., 50 sect. 5, р. 65 — 84, 1968.

4. lethods in Enzymology, v. 12, part. В., sect. 1, р. 3 — 65, 1968 (прототип).