Способ получения гетерогенных биокатализаторов

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОГЕННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ формованием прядильного раствора, полученного эмульгированием водного раствора фермента и веществ, необходимых для образования в водной фазе эмульсии пространственно-структурированного полимера, включающего фермент, в растворе полимера в несмешивающемся с водой органическом растворителе, отличающийся тем, что, с целью увеличения эффективности иммобилизации фермента и активности биокатализатора, перед формованием в прядильный раствор вводят осадитель в количестве, не вызывающем высаживание полимера.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения гетерогенных биокатализаторов (ферментов, иммобилизованных в нерастворимых матрицах) которые могут найти широкое применение в химической, пищевой, медицинской и микробиологической промышленности. Известен способ получения гетерогенных биокатализаторов иммобилизованных ферментов путем механического включения ферментов в структуру полимерного материала (волокон, пленок. Гетерогенные биокатализаторы этого типа могут быть получены достаточно просто: водный раствор фермента эмульгируют в растворе волокнообразующего полимера в несмешивающемся с водой органическом растворителе и из полученного прядильного раствора, содержащего фермент, формуют волокно по сухому или мокрому способу. Однако при механическом включении ферментов в структуру полимерного материала (волокон, пленок) не всегда достигается необходимая стабильность иммобилизированного фермента, при этом не весь фермент достаточно прочно фиксируется в структуре полимерного материала и постепенно десорбируется из него. Это приводит к уменьшению срока службы гетерогенного биокатализатора и к загрязнению получаемого в ферментативном процессе целевого продукта. Между тем, известно, что в целом ряде случаев загрязнение белковыми примесями (ферментами) продуктов реакции, особенно медицинских препаратов, недопустимо из-за возможных аллергических реакций, и, следовательно, в медицинской промышленности должны быть использованы гетерогенные биокатализаторы, содержащие необратимо связанные ферменты. Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения гетерогенных биокатализаторов, содержащих необратимо связанные ферменты, заключающийся в том, что фермент включают в структуру полимерного материала формованием из прядильного раствора, полученного эмульгированием водного раствора фермента в растворе полимера в несмешивающемся с водой органическом растворителе с последующим образованием в водной фазе эмульсии пространственно-структурированного полимера, включающего фермент, и превращением эмульсии в суспензию. Для этого в водный раствор фермента перед эмульгированием вводят по крайней мере один водорастворимый мономер, способный образовывать пространственно-структурированный полимер, и компонент инициирующей полимеризацию системы, затем после образования эмульсии добавляют второй компонент инициирующей полимеризацию системы, а после полимеризации мономеров в водной фазе и превращения эмульсии в суспензию формуют полимерный материал. В случае иммобилизации по тому способу ферментов с мол.мас. менее 100 тыс в водный раствор фермента дополнительно к мономеру и компоненту инициирующей полимеризацию системы вводят полифункциональный сшивающий реагент, способный реагировать с функциональными группами фермента и пространственно-структурированного полимера. Полифункциональный сшивающий реагент может быть введен и в готовую эмульсию водного раствора фермента в растворе полимера в несмешивающемся с водой органическом растворителе. В прядильном растворе, содержащем набухший в воде пространственно-структурированный полимер, включающий фермент, невозможен переход эмульсии типа "вода в масле" в эмульсию "масло в воде". Благодаря этому становится возможным повышение концентрации волокно- или пленкообразующего полимера в прядильном растворе как путем отгонки из раствора части органического растворителя, так и путем смешения его с более концентрированным раствором полимера. Возможно также формование полимерного материала непосредственно из полученного прядильного раствора. В известных способах волокно формуют по сухому или мокрому способу, а пленки по сухому способу. Пространственно-структурированный полимер, включающий фермент, может быть получен в водной фазе эмульсии и при взаимодействии только полифункционального сшивающего реагента с ферментом или с ферментом и водорастворимым полимером. При этом полифункциоальный сшивающий реагент может быть введен в водный раствор фермента или в готовую эмульсию водного раствора фермента в растворе полимера в несмешивающемся с водой органическом растворителе. Указанный способ позволяет получать гетерогенные биокатализаторы, содержащие необратимо связанные ферменты. Эффективность иммобилизации при этом способе составляет для уреазы 23,7% (при активности иммобилизованной уреазы 9 тыс. ед/г), для пенициллинамидазы от 19,2 до 56% (при активности иммобилизованной пенициллинамидазы до 30 тыс. ед/г), а для трипсина 14% Недостатком указанного способа получения гетерогенных биокатализаторов пленок и волокон, содержащих фермент, включенный в пространственно-структурированный полимер, является относительно низкая эффективность иммобилизации фермента и каталитическая активность гетерогенного биокатализатора. Целью предлагаемого изобретения является увеличение эффективности иммобилизации фермента и каталитической активности гетерогенного биокатализатора. Поставленная цель достигается тем, что в прядильный раствор перед формованием полимерного материала (например, в виде волокна или пленки) вводят осадитель в количестве, не вызывающем осаждения полимера. Способ заключается в следующем. В растворе волокно- или пленкообразующего полимера в несмешивающемся с водой органическом растворителе эмульгируют водный раствор фермента с последующим образованием в водной фазе эмульсии пространственно-структурированного полимера, включающего фермент. В результате этого эмульсия водного раствора фермента в растворе волокно- или пленкообразующего полимера в несмешивающемся с водой органическом растворителе превращается в суспензию, включающего фермент пространственно-структурированного полимера в растворе волокно- или пленкообразующего полимера в органическом растворителе. Затем в прядильный раствор перед формованием полимерного материала вводят осадитель, в количестве не вызывающем осаждения полимера. Осадитель может быть введен непосредственно в полученный прядильный раствор или в прядильный раствор, концентрация волокно- или пленкообразующего полимера в котором увеличена путем отгонки части органического растворителя, смешения с более концентрированным раствором полимера или растворения дополнительного количества полимера. При выборе осадителя в каждом конкретном случае необходимо учитывать возможность инактивации фермента при контакте с осадителем в прядильном растворе. Нижеследующие примеры иллюстрируют предлагаемый способ получения гетерогенных биокатализаторов. П р и м е р 1. Прядильный раствор получают по следующей методике: к раствору 4 г триацетата целлюлозы в 100 мл метиленлорида при комнатной температуре добавляют охлажденный до 0^оС раствор, представляющий собой смесь 40 мл раствора пенициллинамидазы в 0,3 М фосфатном буфере рН 7,5 (ферментативная активность 24500 ед/мл, содержание белка 82 мг/мл); 4 мл раствора в воде смеси акриламида и метилен-диакриламида (весовое соотношение мономеров 9: 1, концентрация в растворе (500 мг/мл); 2 мл 25% водного раствора персульфата аммония и проводят эмульгирование при 20^оС в течение 20 мин при перемешивании (700 об/мин). К полученной эмульсии добавляют 8 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгируют еще 15 мин при 20^оС. Затем добавляют 1 мл N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина и перемешивают 10 мин при 20^оС (50 об/мин). К полученной суспензии включающего фермент пространственно-структурированного полимера в растворе триацетата целлюлозы в метиленхлориде добавляют 6 г триацетата целлюлозы и проводят растворение в течение 2 ч при 20^оС. Полученный прядильный раствор разделяют на две равные части. Из первой части формуют пленку по сухому способу (пленка 1а). К второй части прядильного раствора добавляют 6% изопропилового спирта (от веса метиленхлорида), размешивают 20 мин, а затем формуют пленку по сухому способу (пленка 1б). Все пленки промывают водой, 1М раствором хлористого натрия, водой и помещают на хранение в 0,066М фосфатный буфер (рН 7,5, 4^оС). Ферментативная активность полученных препаратов^* и эффективность иммобилизации^** равны соответственно для 1а 13000 ед/г сухой пленки (22,4%) и для 1б 19920 ед/г сухой пленки (35,1%). (^* За 1 единицу активности пенициллинамидазы принято количество фермента, которое образует 1 мк-моль 6-аминопеницилановой кислоты при гидролизе 0,016М раствора бензилпенициллина в 0,066М фосфатном буфере, рН 7,5 при 41±1^оС в течение 1 ч. ^** Отношение активности иммобилизованного фермента к активности введенного в прядильный раствор фермента). П р и м е р 2. Прядильный раствор получают по следующей методике: к раствору 4 г триацетата целлюлозы в 100 мл метиленхлорида добавляют 40 мл раствора пенициллинамидазы в 0,066М фосфатном буфере рН 7,5 (ферментативная активность 24500 ед/мл, содержание белка 82 мг/мл) и эмульгируют 20 мин при 20^оС при перемешивании (700 об/мин). К полученной эмульсии добавляют 8 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгируют еще 15 мин при 20^оС. Затем в полученную суспензию вводят концентрированный раствор 6 г триацетата целлюлозы в метиленхлориде и перемешивают в течение 1 ч при 20^оС. Полученный прядильный раствор разделяют на три равные части. Из первой части формуют пленку по сухому способу (пленка 2а). К второй части прядильного раствора добавляют 6% изопропилового спирта (от веса метиленхлорида), размешивают 20 мин, и формуют пленку по сухому способу (пленка 2б(. К третьей части прядильного раствора добавляют 6% воды (от веса метиленхлорида), размешивают 20 мин, а затем формуют пленку по сухому способу (пленка 2в). Все пленки промывают и хранят по описанному выше методу. Ферментативная активность полученных препаратов и эффективность иммобилизации равны соответственно для 2а 14450 ед/г сухой пленки (22,0%), для 2б 19500 ед/г сухой пленки (30,4%), для 2в 16470 ед/г сухой пленки (25,7%). П р и м е р 3. Прядильный раствор получают по следующей методике. К раствору 10 г триацетата целлюлозы в 250 мл метиленхлорида добавляют 40 мл охлажденного до ^оС раствора пенициллинамидазы в 0,3М фосфатном буфере рН 7,5 (ферментативная активность 40000 ед/мл, содержание белка 160 мг/мл) и эмульгируют при перемешивании мешалкой (700 об/мин) в течение 20 мин при 20^оС. К полученной эмульсии приливают 8 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгируют в тех же условиях еще 15 мин. Из полученной суспензии ферментативного препарата в растворе триацетата целлюлозы в метиленхлориде путем продувания воздуха над перемешивающейся суспензией отгоняют часть метиленхлорида до концентрации в растворе 6% Полученный прядильный раствор разделяют на две равные части. Из первой части формуют пленку по сухому способу (пленка 3а). К второй части прядильного раствора добавляют 10 мл изопропилового спирта, размешивают 20 мин и формуют пленку по сухому способу. Пленки промывают водой, 1М раствором хлористого натрия, водой и помещают на хранение в 0,066М фосфатный буфер. Ферментативная активность полученных препаратов и эффективность иммобилизации равны соответственно для пленки 3а 39000 ед/г сухой пленки (45,0%) и для пленки 3б 44900 ед/г сухой пленки (51,6%). П р и м е р 4. К раствору 10 г триацетата целлюлозы в 150 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют 55 мл охлажденного до 0^оС раствора пенициллинамидазы в 0,3М фосфатном буфере рН 7,5 (ферментативная активность 40000 ед/мл, содержание белка 160 мг/мл) и эмульгируют в течение 20 мин при 20^оС при перемешивании мешалкой (700 об/мин). К полученной эмульсии добавляют 14 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгируют в тех же условиях еще 15 мин. Указанный прядильный раствор разделяют на 2 равные части. Из одной формуют пленку по сухому способу (пленка 5а). К второй части добавляют 6% изопропилового спирта (от веса метиленхлорида), перемешивают 20 мин и формуют пленку по сухому способу (пленка 5б). Пленки промывают водой, 1М раствором хлористого натрия, водой и помещают на хранение в 0,066М фосфатный буфер (рН 7,5, 4^оС). Ферментативная активность полученных пленок и эффективность иммобилизации равны соответственно для пленки 5а 52800 ед/г сухой пленки (50,9%) и для пленки 5б 58000 (55,7%). П р и м е р 5. Прядильный раствор получают по следующей методике: к раствору 10 г триацетата целлюлозы в 256 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют смесь 20 мл раствора трипсина в 0,3М фосфатном буфере рН 7,0 (концентрация фермента 10 мг/мл) и 1,6 мл 2,5% водного раствора глутарового альдегида. Эмульгирование проводят при 20^оС 20 мин при механическом перемешивании (600 об/мин). Из полученного раствора отгоняют часть метиленхлорида путем продувания воздуха над перемешивающимся прядильным раствором до концентрации триацетата целлюлозы в метиленхлориде 9% и выдерживают прядильный раствор в течение 1 ч при 20^оС. Полученный прядильный раствор разделяют на две равные части. Из первой части формуют пленку по сухому способу и по мокрому способу в изопропиловый спирт (соответственно пленки 4а и 4б). К второй части прядильного раствора добавляют 10% (от массы триацетата целлюлозы) изопропилового спирта, размешивают 10 мин, а затем формуют пленки по сухому способу и по мокрому способу в изопропиловый спирт (с последующей промывкой водой) (соответственно пленки 4в и 4г). Все пленки промывают 1М раствором NaCl, содержащим HCl (рН 3,0) при многократной смене промывного раствора, затем промывают водой и сушат. Эффективность иммобилизации составляет для сформованных по сухому способу пленок 4а 20% и 4в 25% а для сформованных по мокрому способу пленок 4б и 4г соответственно 24% и 27% П р и м е р 6. Прядильный раствор получают по следующей методике: к раствору 10 г триацетата целлюлозы в 256 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют смесь 10 мл раствора трипсина в 0,3М фосфатном буфере рН 7,0 (концентрация фермента 10 мг/мл) и 0,8 мл 2,5% водного раствора глутарового альдегида. Эмульгирование проводят при 20^оС 20 мин при механическом перемешивании (600 об/мин). Из полученного прядильного раствора отгоняют часть метиленхлорида путем продувания воздуха над перемешивающимся раствором до концентрации триацетата целлюлозы в метиленхлориде 9% и выдерживают раствор в течение 1 ч при 20^оС. Полученный раствор разделяют на две части равные. Из первой части формуют волокно по мокрому способу в изопропиловый спирт. К второй части прядильного раствора добавляют 10% (от массы триацетата целлюлозы) изопропилового спирта, размешивают 10 мин, а затем формуют волокно по мокрому способу в изопропиловый спирт с последующей промывкой водой. Все волокна промывают 1М раствором NaCl, содержащим HCl (рН 3,0) при многократной смене промывного раствора, затем промывают водой и сушат. Эффективность иммобилизации трипсина в волокнах, полученных без добавления и с добавлением изопропилового спирта в прядильный раствор, составляет соответственно 20% и 29% П р и м е р 7. К раствору 10 г полиарилата Ф-1 в 150 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют 55 мл охлажденного до 0^оС раствора пенициллинамидазы в 0,3М фосфатном буфере рН 7,5 (ферментативная активность 40000 ед/мл, содержание белка 160 мг/мл) и эмульгируют в течение 20 мин при 20^оС при перемешивании мешалкой (700 об/мин). К полученной эмульсии добавляют 14 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгируют еще 15 мин. Полученный прядильный раствор делят на 2 равные части. Из одной формуют пленку по сухому способу (пленка 7а). К второй части добавляют 6% изопропилового спирта (от веса метиленхлорида), перемешивают 20 мин и формуют пленку 7б по сухому способу. Пленки промывают водой, 1М раствором хлористого натрия, водой и помещают на хранение в 0,066М фосфатный буфер (рН 7,5, 4^оС). Ферментативная активность и эффективность иммобилизации равны соответственно для пленки 7а 60000 ед/г сухой пленки (57,9%), пленки 7б 70000 ед/г сухой пленки (67,1%). П р и м е р 8. Прядильный раствор получают по следующей методике: к раствору 10 г триацетата целлюлозы в 256 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют смесь 10 мл раствора трипсина в 0,3М фосфатном буфере рН 7,0 (концентрация фермента 10 мг/мл), 10 мл водного раствора полиэтиленимина с концентрацией 250 мг/мл и 1,6 мл 2,5% водного раствора ди-4,4''(4'',6''-дихлор-S-триазинил)-амино-стильбен-2-2'- дисульфокислоты. Эмульгирование проводят при 20^оС 20 мин при механическом перемешивании (600 об/мин). Из полученного раствора отгоняют часть метиленхлорида путем продувания воздуха над перемешивающимся раствором до концентрации триацетата целлюлозы в метиленхлориде 5% и выдерживают прядильный раствор в течение 1 ч при 20^оС. Указанный прядильный раствор разделяют на две равные части. Из одной формуют пленку по сухому способу (пленка 8а). К второй части добавляют 10% изопропилового спирта (от массы метиленхлорида), перемешивают 20 мин и формуют пленку по сухому способу (пленка 8б). Пленки промывают водой, 1М раствором хлористого натрия, содержащим HCl (рН 3,0) при многократной смене промывного раствора, затем промывают водой и сушат. Эффективность иммобилизации трипсина для пленки 8а составляет 20,0% а для пленки 8б 25% П р и м е р 9. Прядильный раствор получен по следующей методике: к раствору 5 г поливинилацетата в 70 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляли смесь 30 мл раствора пенициллинамидазы в 0,3М фосфатном буфере (ферментативная активность 20000 ед/мл, содержание белка 53 мг/мл), 3 мл раствора смеси акриламида и метилендиакриламида (весовое соотношение мономеров 9:1, общая концентрация 500 мг/мл), 0,5 мл N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина и 0,5 мл 10% раствора соли Мора. Эмульгирование проводили 20 мин при 20^оС и механическом перемешивании (750 об/мин). В полученную эмульсию добавляли 6 мл 25% раствора глутарового альдегида и эмульгировали еще 15 мин при 750 об/мин, затем добавляли 0,5 мл гидроперекиси изопропилбензола, перемешивали 15 мин, добавляли 5 г поливинилацетата и перемешивали при 50 об/мин 2 ч. Полученный раствор разделяли на две равные части. Из одной формовали пленку 9а по сухому способу. К второй части добавляли гексан (10% от массы метиленхлорида), перемешивали 20 мин и формовали пленку 9б по сухому способу. Пленки промывали водой, 1М раствором хлористого натрия, водой и хранили в 0,066М фосфатном буфере при 4^оС. Ферментативная активность и эффективность иммобилизации полученных препаратов составляла для пленки 9а 11130 ед/г сухой пленки и 27% для пленки 9б 13600 ед/г сухой пленки и 33% соответственно. П р и м е р 10. Прядильный раствор был получен по следующей методике: в растворе 4 г полистирола в 80 мл метиленхлорида при 20^оС эмульгировали 20 мин при перемешивании мешалкой (700 об/мин) смесь 40 мл раствора пенициллиламидазы в 0,3М фосфатном буфере (ферментативная активность 30000 ед/мл, содержание белка 79 мг/мл), 10 мл водного раствора, содержащего 15% акрилата кальция и 10% акриламида, и 1 мл 25% раствора персульфата аммония. К полученной эмульсии добавляли 6 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгировали 15 мин при 700 об/мин, добавляли 0,5 мл N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина и перемешивали 10 мин (50 об/мин). Затем к полученному раствору добавляли 6 г полистирола и перемешивали 1 ч (50 об/мин) до полного растворения полимера. Полученный прядильный раствор разделяли на две равные части. Из одной формовали по сухому способу пленку 10а. К второй части добавляли петролейный эфир (10% от массы метиленхлорида), перемешивали 20 мин и формовали по сухому способу пленку 10б. Пленки промывали водой, 1М раствором хлористого натрия и водой. Пленки хранили в 0,066М фосфатном буфере при 4^оС. Ферментативная активность и эффективность иммобилизации составляли для пленки 10а 19800 ед/г сухой пленки и 28,2% а для пленки 10б 24500 ед/г сухой пленки и 35% П р и м е р 11. Прядильный раствор был получен по следующей методике: к раствору 4 г триацетата целлюлозы в 100 мл метиленхлорида при 20^оС добавляли при перемешивании раствор, представляющий собой смесь 40 мл раствора уреазы в 0,25М фосфатном буфере с рН 7,0 (ферментативная активность^* 39470 ед/мл, содержание белка 115 мг/мл), 4 мл раствора смеси акриламида и метилендиакриламида (весовое соотношение мономеров 9:1, общая концентрация 500 мг/мл) и 1 мл 25% раствора персульфата аммония и эмульгировали в течение 20 мин при 700 об/мин. К полученной эмульсии добавляли 0,5 мл N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина и перемешивали 10 мин при 50 об/мин, затем добавляли 6 г сухого триацетата целлюлозы и растворяли при перемешивании в течение 2 ч. Прядильный раствор разделяли на две равные части. Из первой формовали пленку 11а по сухому способу. К второй части прядильного раствора добавляли воду (8% от массы метиленхлорида), размешивали 15 мин и формовали пленку по сухому способу (пленка 11б). Полученные пленки промывали водой, 1М раствором хлористого натрия, водой и 0,1М фосфатным буфером с рН 7,0. Ферментативная активность и эффективность иммобилизации для пленки 11а равна 21200 ед/г сухой пленки и 20,2% для пленки 11б 27400 ед/г сухой пленки и 26,1% (^* За единицу активности уреазы принято количество фермента, которое образует 1 мк-моль аммиачного азота при гидролизе 2% раствора мочевины в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,0) при 20^оС в течение 1 ч). Таким образом, предложенный способ позволяет увеличить эффективность иммобилизации фермента и каталитическую активность гетерогенного биокатализатора, содержащего необратимо связанный фермент. Эффективность иммобилизации ферментов при предлагаемом способе составляет для пенициллинамидазы от 25,7 до 77,1% (при активности иммобилизованной пенициллинамидазы до 70 тыс. ед/г), а для трипсина 25-29% При формовании из одного и того же прядильного раствора по предлагаемому способу вместо известного эффективность иммобилизации пенициллинамидазы возрастает (см.примеры) на 10-56% (относительных), а трипсина на 13-45%

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОГЕННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ формованием прядильного раствора, полученного эмульгированием водного раствора фермента и веществ, необходимых для образования в водной фазе эмульсии пространственно-структурированного полимера, включающего фермент, в растворе полимера в несмешивающемся с водой органическом растворителе, отличающийся тем, что, с целью увеличения эффективности иммобилизации фермента и активности биокатализатора, перед формованием в прядильный раствор вводят осадитель в количестве, не вызывающем высаживание полимера.