Штамм lастовасillus асidорнilus 17-продуцент бактериоцина а 17

 

О Il И С А H И Е (854981

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик (6I ) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлечо 28.05.79 (21) 2774106/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (51) М. Kil a

С I2N I 00

С 12R !23

Гооударстееикык комятет

Опубликовано 15.08.81. Бюллетень № 30 (53) УДК Ь 576.8. .097.35 (088.8)

Д по делам изобретений и открытий ата опубликования описания 25.08.81 (54) ШТАММ LACTOBACILLUS AC! D0PHILUS 17—

ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИОЦИНА А 17

Изобретение относится к микробиологии и касается получения нового штамма продуцента антибиотика бактериоцина, который может быть использован для бактериоцинотипирования и бактериоциногенотипирования лактобацилл, а также в исследованиях для излучения генетических элементов, детерминирующих синтез бакте. риоцина, их функциональных особенностей, химического состава,,механизма действия.

Известен штамм L. piaretarum 109-продуцент бактериоцина (1).

Однако спектр действия этих бактериоцинов ограничивается подавлением роста ряда культур L. acidophiius, L. salivarins, jugurti, L. helveticus, L.lactis, 1..т!е1вrueckii, !. fermenti H L.auchneri.

Целью изобретения является новый штамм Lactoaacillus acidophilus 17, продуцирующий бактериоцин активный и против других видов лактобацилл.

Предложенный штамм выделен из слюны человека.

Штамп Lactoaaci i!us acidophilus 17-продуцент бактериоцина А 17 депонирован в

Музее культур промышленных микроорга2 низмов института «ВНИИ генетика» под номером ЦМПМ В -182б.

Морфологические признаки. На среде

МРС-I (48-часовая культура): умеренно полиморфные палочки 3 — 5 Х 0,6 — 0,8 мкм, располагающиеся поодиночке, с закругленными концами. Волютиновых зерен не образуют, грамположительны. Спор и капсул не имеют. Неподвижны.

Культуральные признаки. Ацетатный агар. Через 72 ч роста при 37 в атмосфере углекислого газа образует до 2 мм в диаметре круглые, серовато-беловатого цвета колонии с выпуклой, гладкой, блестящей поверхностью, полупрозрачные, с волнистым краем, зернистой структурой, мягкой консистенции.

1» Среда МРС- l. Через 24 ч при 37 равномерное помутнение и небольшой а.аорфный осадок.

Состав среды МРС-I.

1. Дистиллированная вода 200 мл, M„SO» ° 4На О 50 мг, цистеин 200 мг, :Мо 5От, ° 7НаО 200 мг, КНаРОе 2 г, цитрат аммония 2 г, ацетат натрия 5 г, глюкоза 20 г.

854981

2. Дистиллированная вода 100 мл, пептон 10 r, твин 80 1 мл, дрожженой автолизат 50 мл, печеночный экстракт 100 мл.

3. Гидролизованное молоко до л; рН 6,2 — 6.6

l,5"/ агаровая скошенная срела МРС- I.

Через 48 ч роста ири 37 налет сероватобеловатого цвета с гладкой блестящей поверхностью, полупрозрачный, мягкой консистенции, располагающийся на поверхности среды.

Среда МРС-5 (среда МРС-1 без нитрата аммония и ацетата натрия).

Через 24 ч ири 37" равномерное помутнение и небольшой аморфный осадок.

Срела МРС-2 (среда МРС-1 с 0,15 /о агара). Не растет при 50 и 15 . !5

Среда МРС-2 с 0,4 /„тииоля. Рост отсутствует.

Обезжиренное молоко с 5 /р дрожжевого автолизата и 1 "/р глюкозы. Створаживание иа 2- 3 сутки. го

Срела Дейвиса (глн>коза 10 г, дрожжевой автолизат 50 мл, мел 100 г, хлорфениловый красный 40 мг, обезжиренное молоко ло 1 л). (твораживание и иожелтение среды на 2- 3 сутки. Молоко. Створаживание 2s на 3 сутки.

Физиологические и биохимические признаки. Факультативный анаэроб. Оптимальный рост ири 32 — 37 . 7Келатину не разжижает. Нитраты в нитриты не восстанавливает. Каталазу не образует.

Среда Гибсона и Абд-эль-Малека. Ферментирует глюкозу без образования газа.

Ферментирует целлобиозу, галактозу, мальтозу, сахарову, маннозу, лактозу и салицин с образованием кислоты. Не расщеиляСт рамнозу, крахмал, сорбит и маннит, Молоко. Через 14 сут. содержание кислот достигает 0,65 /р.

Антагонистические свойства. Образует бактериоцин А 17 на 1,5 /, агаровой среде

МРС-i. и жидкой среде МРС-I.

Получение бактериоцина на 1,5"/0 агаровой среде МРС- I. Суточную культуру

L.acidophi1us l7 засевают уколом на чашку с 1,5Р/р агаровой средой МРС-1 и выращивают 3 сут прн 37 в вакуум-эксикаторах, в которых воздух заменен углекислым газом.

Выращенную макроколонию стернлизуют парами хлороформа, после чего поверхность среды заливают вторым слоем (4 мл)

0,8 /р агаровой среды МРС- I, расплавлен- 50 ной и охлажденной до 46, смешанной с

0,5 мл 4 часовой индикаторной культуры

L.jugurti NC3B 2889.

После застывания среды посевы выращивают при 37 в течение 2 сут. Вокруг макроколонии L.acidophilus 17 наблюдает- 55 ся прозрачная с нечетюi.ì краем зона подавления роста индикаторного штамма (18 мм в диаметре) .

Получение бактериоцина А 17 На жилкой среде М РС- I . Культуру L. aci doph i 1 us

17 засевают на жидкую среду МРС-1 и выращивают при 37 за 4 сут. Для стерилизациици и к культуре добавляют 100/o хлороформа, перемешивают и выдерживают ири 37 в течение 30 мин, после чего жидкость отделяют от хлороформа и центрифигуруют. Из насадочной жидкости готовят двукратные серийные разведения. По одной петле каждого разведения наносят на поверхность чагцки с 1,5 /р агаровой средой

МРС- I, засеянной 4-часовой индикаторной культурой L.jugurti NC3B 2889. После выращивания при 37 в течение 2 сут производят учет. Титр бактериоцина А 17 на жидкой среде МРС- I 1:16.

Спектр действия бактериоцина А 17. Подавляет рост ряла культур L.acidophilus, L.salivarius, L.helveticul L.jugurti, L.lactis, L.delaruecmii, 1. fermenti. L.auchneri, L.leichn>annii и L.celloaiosus.

Не ингибируют рост культур L.casei, I..plantarum, L.arevis u L.Viridescens.

Бактериоцин А 17 инактивируется трипсином и химатрипсином, но резистентен к действию папаина, ДНК-азы, РНК-азы, и лизоцима. При 60 разрушается в течение

30 мин. Бактериоцин А 17 не реплицируется на индикаторном штамме L.jugurti NC3B

2889 и хорошо диффунди рует в а га р. Не диффундирует через целлофан.

Предлагаемый штамм L.acidophilus 17 по сравнению с известными продуцирует бактериоцин А17, который активен против ряда других видов лактобацилл, что может быть использовано для бактериоцинотипирования не только культур L.acidophilus, L.salivarins, L.helveticus, jugurti, L.lactis, L.del вгцеск11, !еггпеп(i H L.auchneri, но и культур L.leichmannii u L.ceÈoaiosus.

По чувствительности к бактериоцину AI7 (бактериоцинотипирование) культуры

L.acIdophitus, L.saI ivari us, L.he1veticus, jugurti, L.lactis, Ldeleruecsii, 1. fermenti и L.auchneri, а также L.leichmannii и L,celloaiosus подразделяются на два бактериоцинотипа: чувствительный к бактериоцину

AI7 (l) и устойчивый к бактериоцину

А17 (2).

При бактериоцинотипировании 588 культур лактобацилл разных вилов получены следующие данные: из 187 культур L.acidophilus 9 культур относились к (1) и 178-к (2); из 65 культур (..salivarins 4 относились к (I) и 61 — ко (2); из 16 культур jugurti 6 относились к (!) и !О ко (2); из 4 культур L.helveticus 3 относились к (1) и I — к (2); из 84 культур

1.Леггпеп(1 1 относилась к (I) и 83 -- к (2); из 13 культур(.auchneri 2 относились к (1) и 11 — к (2); из 2 культур L.leichmannii

1 относилась к (1) и 1 — ко (2); из 3 культур L.eel loaiosus 2 откосились к (1) 854981 формула изобретения и 1 --- ко (2); 2 культуры L.lactis u I культура L.delsmecxi i относились к (! ) . 211 культур L.casei, 1.plantarum, L.arevis u

L.Videsceus были устойчивыми и к бактериоцину А17.

По способности продуцировать бакте- $ риоцин A I 7 (бактериоциногенотипирование) культуры лактобацилл указанных выше видов подразделяются на два бактериоциногенотипа: продуцирующий бактериоцин А17 и не продуцирующий бактериоцин Al?.

Штамм L.acidophilus 17 может использоваться в исследованиях по генетике и физиологии ба ктериоциногении лактобацилл при изучении химического состава бактериоцина AI?, механизма действия на чувствительные бактерии.

1S

Применение предлагаемого штамма дает возможность по генетическим меткам (чувствительность или устойчивость к бактериоцину А17, наличие или отсутствие способности продуцировать бактериоцин А! 7) проводить дальнейшее, более глубокое и детальное внутривидовое подразделение не

6 только культур L.acIdophi lus, L.salivarius, L.helveticus, L.jugurti, L.lactis, L.delaIIIeckii, Е ferment! u L.aachneri, но н куль1ур L.leichmannl i u L.eel lobiosus, обладающих одинаковыми биохимическими и физиологическими свойствами, на бактериоцинотипы и бактериоциногенотипы (бактериоцинотипирование и бактериоциногенотипирование).

Штамм Lactoaaci i!us acidophilus 17 продуцет бактериоцина А! 7 (депонирован в Музее культур промышленных микроорганизмов института «ВНИИ генетика» под нохмером ЦМПМ В-1826).

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР по заявке № 2685277/28-13, кл. С 12 D 9/22, 1 978.

Редактор И. Нестерова

Заказ 7444 32

Составитель С. Малютина

Техред А. Бойкас Корректор Н. Швыдкая

Тираж 528 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений н открытий

I I 3035, Москва, )К вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4