Способ получения антибиотического комплекса

 

Союз Советских

Социалистических республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (61) До олнительньит к патенту (22) Заявлено 10p 567 (21) 1157604/28-13 (51) M

3 (23) Приоритет - (32) С 12 P 1/06

Государствеиимй комитет

СССР ио делам яюбретеяяя и открмтяй (33) СщА (31) Опубликовано 2311,81,Бюллетень йо 4 3

Дата опубликования описания 2Ы1,81 (53) УДК 615. 779 °

° 931(088.8) Иностранцы

Роберт Куинси Томпсон, Уильям Макс Старк и Калвин Евгений Хиггенс (США) 1,,»;

Иностранная фирма

"Эли Лнлли эид Компани" (аы) (72) Авторы изобретения (71) Заявитель; (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО

КОМПЛЕКСА

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения антибиотиков °

Предлагаемый антибиотический комп- лекс новый и способ егб получения в научно-технической и патентной литературе не описан.

Цель изобретения — получение антибиотического комплекса.

Поставленная цель достигается тем, что штамм Streptomyces teaebrarius

АТСС 17920 культивируют в глубинных условиях аэробно в питательной среде содержащей источники углерода, азо та и минеральные соли при температу- 15 ре 37-43оС в течение 4-7 дней, затем выделяют целевой продукт в свободном виде или в виде его солей и при необходимости разделяют комплекс на сос-.. тавные антибио ические компоненты 1), )И, ф, g и ф и переводят их-в сали.

Йовый антибиотический комплекс характеризуется наличием семи компонентов, из которых каждый отличается активностью, свойственной антибиотику.

Этот комплекс, в качестве свободного основания pcLcTBopHM B воде и диметилсульфоксиде, слабо растворим в метаноле и нерастворим в большинстве других органических растворителей, таких как ацетон, высшие спирты,диоксан, этилацетат, диэтиловый эфир, ацетонитрнл, метил-изобутил кетон и растворители, относящиеся к классу углеводородов.

Свободное основание комплекса усе тойчиво при пониженных температурах и температуре 37 С. о

Антибиотический комплекс тенебримицин содержит семь разлнчнйх факторов (компонентов : тенебримнцин Г, тенебримицин Т; тенебримицин Й, тенебримицин Щ тенебримицин ф, тенебримицин Я и тенебримнцин-gi,.

В . комплексе, получаемом ттрн обычных условиях, тенебримицин I тенебримицин Е и тенебримицин Щ присутствуют -в незначительных количествах, Тенебримнцин К входит в состав в количестве 45-50% и тенебримицин содержится в комплексе в количестве около 30%, тенебримицин ф присутствует в количестве около 15-20%, а тенебрнмицин т1 около 10%.

Тенебримиций Tj являетСя белым ,твердым веществом. Электрометрическое титрование в водной среде пока884575 эывает наличие способных титроваться группировок, имеющих значения рН около 5,7; 6,7 7,7 и 8,7. Удельное вращение, определяемое в свете линии 0 натрия при 25оС, обусловленное данным фактором, равна +159, ес.— ли концентрация антибиотика равна 1Ъ, считая на весовое количество приходящееся на единицу объема в водном растворе.. Данные микроорганизма свидетельствуют о том, что тенебримицин имеет приблизительно следующий процентный состав: С 46,47; Н 7,99; N

13,05> 0 32,29. Молекулярный вес, по результатам титрования, составляет около 539. Эмпирическая формула

С1 Н44М 5011 ° (15

Инфракрасный спектр поглощения те-. небримицина Й в среде, содержащей минеральное масло, показывает следующие различимые полосы в составе спектров инфракрасного поглощения в Я{) пределах от 2 до 15 мк: 3,02; 3,14;

60,5; 6,23; 7,4; 8,5; 8,75; 9,17;

Тенебримицин 1 образует ацетильное производное, имеющее удельное вра-2 щение Pd ) Ql около 130 при концентрации соединения 1В, считая на весовое .количество, приходящееся на единицу .объема в водном растворе. У производного не имеется оставшихся группировок, способных титроваться. Элементарный состав, определенный по ме- . тоду микроорганизма, показывает, что к структуре тенебромицина ll присоединяются четыре ацетильные группировки.

Тенебримицин Я является основныи веществом, содержащим группировки, способные титроваться, имеющим значения показателя pKi. а около 5,3; 6,8;

7,8 и 9,0, судя по данным электрометрического титрования, в воде, 40

Удельное вращение тенебримицииа ф определенное в 1Ъ-ном водном растворе при 25о С, равно +114. Процентный состав тенебримицина и по данным микроанализа; С 41,91; H 7,53 N 15,16.4g

Молекулярный вес„ определенный по данным титрования — около 544. Эмпирическая формула для тенебримицина ф

С,, Н N

6 нфракрасный спектр поглощения те- небримицина в среде минерального масла показывает различные полосы поглощения в пределах 2-15 мк составляют: 3,05. 3g17g 5, 85; 6,27 7,46;

8,75 9,7 10, 5; 11.,1 и 12,85 мк.

Тетра-ацетильное производное тенебрнмицина l9 является твердым, кристаллическим веществом с точкой плавления около 265-267оС. Удельное вращение )DE<100 в том случае, если концентрация производного равна 1% в 49 водном растворе.

Электрометрическое титрование тенебримицина свидетельствует о иаличии способных титроваться rpynnuposos, имеющих значение рК а около 5,5; gg

7,0 8,0 и 9,1. Удельное вращение в свете О линии натрия в однопроцентном водном растворе данного фактора, определяемое при 25 С, +118 . Элементарные составы, определенные по методу микроорганизма, таковы: С 43,21;

Н 7,86; М 13,69. Молекулярный вес равен 483. Эмпирическая формула для тенебримицина Y С 8Н Й O@ Н 0.

Спектр инфракрасного поглощения тенебримицина 7 в среде, содержащей минеральное масло, имеет следующие различные полосы в пределах 2-15 мк, 3,05; 3,19> 6,32; 7,45; 8,75; 9,7;

11,35 и 12,25.мк.

Подобно тенебримицину Ж, тенебримицин М образует кристаллическое тетра-ацетильное производное. Производное плавится с разложением при температуре около 260 С и характео риэуется удельным вращением Щ около +190о, при концентрации 0,42% в водном растворе.

Тенебримицин Я имеет способные титроваться группировки, характеризуемые значениями рК а около 5,6;

7,2; 8,2 и 9,3, определенными в водном растворе путем электрометрического титрования. Молекулярный вес 467.

Удельное вращение в свете 0 линии натрия в однопроцентном водном растворе тенебримицина Д при температуре 25 С равно, примерно + 127. Микроо анализы свидетельствуют о приблизительном процентном составе: С 44,3;

Н 8 у 1; N 14 3; 32 р 8 Эмпирическая формула C H >N>09 Н О»

Спектр инфракрасного поглощения тенебримицина Vj показывает различные полосы поглощения в пределах

2-15 мку 3,05; 3,19; 6,35; 7,47;

8,75, 9,8; 12,3 и 12,95 мк.

Показатель удельного вращения тетра-ацетил производного тенебримицина ф в 1%-ном водном растворе составляет около+95 при определении при

25 С.

Соли, являющиеся продуктами присоединения кислот к тенебримицину или отдельным компонентам, входящим в состав антибиотика, можно получить с помощью обычных методов. Для образования соли примейяют или органические или неорганические кислоты.

Удобный метод получения таких солей заключается в добавлении раствора, кислоты, служащей для образования соли к водному раствору антибиотика.

В случае нерастворимых солей, являющихся продуктами присоединения кислоты, соль осаждается иэ раствора и легко отделяется с помощью обычных технических приемов, таких как фильтрование или центрифугирование. В том случае, когда желаемая соль, являющаяся продуктом присоединения кислоты, быстро не осаждается, то процессу осаждения можно способствовать или конценярируя раствор до меньшего

884575 объема или добавляя к воде смешивающийся с ней растворитель, такой как ацетон или подобный ему. Соль, являющаяся продуктом присоединения кислоты, можно перевести и форму сво бодного основания путем пропускания водного раствора соли над анионообменной смолой н гидроксильном цикле.

Различные факторы, образующие тенебримициноный комплекс можно отличить один от другого,а также от других антибиотиков, обладающих сходными свойствами с помощью технйческих приемов бумажной хроматографии. Хроматографию проводят по обычному нисходящему методу при температуре 22,8+0,6оС. (73ОФ+1 Ф), на бумаге фирюзы "Ватман"

9 1, имеющей размеры 19,1"46,3 см.

Антибиотический комплекс тенебримицина, а также индивидуальные, образующие упомянутый комплекс, обладают ингибирующим действием по от- 2Q ношению к росту микроорганизмов, патогенных для жизнедеятельности животных и растений. Концентрация комплекса и индивидуальных тенебримицинов, при котоРых проявляется тор р5 мозящее действие в части развития ряда организмов, показано в табл.1.

Минимальные ингибирующие концентрации определяют по методу разбавления агара.

ЗО

Острая токсичность тенебримиционного комплекса и сравнительно менее распространенных его составных частей определяют на мышах. Значения доэ "LD"у вызывающих гибель подопытных животных в 50% случаев для тенебримицинсульфата, составляют около 300 мг/кг для случая внутреннего введения, и около 350 мг/кг при введении в брюшную полость. Bce мыши выживают в случае дозировок при под- 40 кожном введении в количестве

750 мг/кг или при скармливании

5600 мг/кг. Не отмечается значительного раздражения при внесении в один глаз каждой из четырех крыс одной 45 капли 50%-ного водного раствора сульфата тенебримицина по три раза в день в течение 5 дней. Получают следующие значения "LD ", выраженные в мг/кг свободного основания для индивидуальных тенебримицинов при внутривенном введении для мышей: тенебримицин Й около 385, тенебримицин IY около 220, тенебримицин V около 140 и тенебримицин ф около 120.

Новый антибиотический комплекс получают в результате культивирования подходящего штамма антиномицетного организма при аэробных условиях .На пригодной для культивирования сре- 60 де до тех пор, пока такая среда не будет обладать значительной активностью, характерной для антибиоти ка. Тенебримицин можно извлечь, применяя для этой цели различные методы 65 выделения и очистки, нанес-. ле н производстве антибиотиков. Комплекс антибиотика может применяться, как таковой или же его можно пс;нергать дополнительным операциям для очистки с целью выделения различных его индивидуальных компонентов с более высокой степенью чистоты.

Штамм представляет собой образующую спираль, устойчивые к воздействию тепла, аэробные по отношению к микроаэрофильным "Streptomyces" споры, имеющие продолговатые гладкие стенки, они ингибируются при искусственном освещении сравнительно небольшой интенсивности.

Штамм Streptomyces tenebrarfus выделен из образца почвы посредством суспендиронания отдельных порций почвы в стерильной дистиллированной воде с последующим переносом суспензий на питательную среду, образованную агаром. Засеянные пластинки с питаю ей средой в виде агара инкубируют при 25-35 С до тех пор, пока не обеспечивался рост. К концу периода инкубиронания колонии организмов, вырабатывающих антибиотик, переносят с помощью стерильной платиновой петли на скошенный агар, затем инкубируют с целью обеспечения достаточных количестн прининочного материала для производства антибиотика. Штаьы организма, применяемого для производства комплексного антибиотика„ помещена на постоянное хранение н коллекцию культур американского типа н Вашингтоне (федеративный округ Колумбия

ClllA), культуре присвоен 9 ATCC 17920.

Морфология.

При выращивании на пептоновом агаре по Чапеку разветвленные формы спор образуются н виде беспорядочных пучков и гроздьев на воздушном мицелии.

Изолированные споры наблюдаются редко. Мицелий в целом„ неповрежденном виде, легко отделяется от субстрата.

Цепочки созревших спор обычно образуют 5-6 открытых спиралей. Споры имеют продолговатую форму, доходящую до цилиндрической. При исследовании под электронным микроскопом споры кажутся гладкими, имеют размеры от

0,7 до 1,3 и от 2,0 до 2,1 мк.

На среде по Беннату наблюдаются утолщения.

Агар Чапека: характеристика роста; редкий, разбросанный; воздушный мицеллий,редкий; светлый, оранжевожелтый> спорообразование удовлетворительное; субстратный,мицелий; светлый, оранжево-желтый, растворимый пигмент слегка розовый.

Пептон по Чапеку: обильный рост; ноз. душный мицелий обильный, светлый, желтовато-коричневый с баль.ми участками обильное спорулиронание; субстратный мицелий светлый, красновато884575 серый, растворимый пигмент; сероваторозовый.

Агар, содержащий кальциевую соль, яблочной кислоты, рост умеренный, воздушный мицелий умеренный, светлый, оранжево-желтый спорообразование умеI

5 ренное, субстратный серовато-розовый, растворимый пигмент серовато-розовый.

Агар тирозиновый: рост ограниченный, скудный, воздушный мицелий скудный,светлый оранжево-желтый, спорулирование незначительное; субстратный мицелий светлый, оранжево-желтый, растворимый пигмейт отсутствует.

Агар, содержащий неорганические соли и крахмал: рост умеренный, воздушный мицелий умеренный, коричневато-розовый с белыми участками, спорообраэование обильное; противопопожный цвет светло-желтый, растворимый пигмент светло-желтый.

Агар, содержащий глюкозу и аспара- 20 гин, рост умеренный, воздушный мице,лий умеренный, светло-желтый с белыми участками,спорообразование умеренное, субстратный мицелий светло-желтый растворимый пигмент отсутствует. 2S

Томатная паста — овсяная мука: рост обильный, воздушный мицелий обильный, светлый желтовато-коричневый, спорообразование обильное, субстратный мицелий темно"серый, красновато-коричневый растворимый пигмент темный, пурпурно-красный.

Дрожжевой экстракт: рост обильный, воздушный мицелий обильный, светлый, оранжево-желтый с белыми участкамиу спорообразование обильное, субстратный мицелий.умеренно-желтый растворимый пигмент отсутствует.

Питательный агар: рост редкий, разбросанный, воздушный мицелий редкий, белый, спорообразование ред- 4О кое, субстратный мицелий сероватозеленовато-желтый, растворимый пигмент отсутствует.

Агар по Беннетуг рост умеренный, воздушный мицелий умеренный белый, спорулирование умеренное, субстратный мицелий светло-желтый, раство. римый пигмент отсутствует.

Действие на молоко: толстое желтое кольцо роста на поверхности. 50

Наблюдается коагуляция и пептонизация. Нитраты восстанавливает, сероводород не образует, желатин полностью разжижает через 14 дней.

Требования в отношении температуры при выращивании на нептоновом агаре по Чапеку:

200 - рост отсутствует;

26 рост. удовлетворительный, воздушный мицелий отсутствует;

30 рост и образование воздушного 60 мицелия умеренные, однако спорообразование отсутствует, 37 рост, образование воздушного мицелия и спорообразование все обильное, 65

43 рост, образование воздушного мицелия и спорулироваиие обильно >

50 рост, образование воздушного мицелия и спорулирование — все обильное;

55 рост скудный, ограниченный, 60 рост отсутствует.

Споры, образованные из суспензии спор, нагреваемой при 75ОС в течение 15 мин остаются жизнеспособными.

В случае нагревания суспензии спор до 1000C в течение 15 мин жизнеспособных спор -не остается.

Красный растворимый пигмент вырабатывается лишь в присутствии иона трехвалентного железа, причем интенсивность пигментации пропорциональна концентрации иона трехвалентного железа в заданных пределах. физиологические свойства: усваивает рибозу, фруктоэу, маннозу, глюкозу, мальтозу, сукроэу, трегалозу, инозитол, салицин. Не усваивает арабинозу, рамнозу, ксилозу, лактозу, раффиноэу, целлюлозу, инсулин, маннитол, с6 -сорбитол.

Штамм Streptomyces tenebrar1us

АТСС 1720 культивируют с помощью обычных приемов в условиях погруженной аэробной культуры в среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, азота и неорганических солей.

Штамм растет хорошо при темпера-. туре от 30 до 50 С. Оптимальной является температура 37-43 C. Организмы

,чувствительны к действию света и пло.Хо растут при освещении. Через среду для выращивания культуры продувают стерильный воздух. Объем воздуха. используемый в процессе ферментации в резервуарах составляет свыше

0,1 об/мин на 1 объем средь- для выращивания культуры.

Концентрация, характеризующая активность антибиотика в ферментационной среде может быть легко прослежена по мере хода ферментации посредством отбора и испытания проб среды для выращивания на их активность в отношении ингибирования роста организмов, которые должны тормозиться в своем развитии в присутствии тенебримицина. Для этой цели применяются два организма: Kiebsiеl1à

pneumoniae u Nicobacterium butyricum. (Максимальный уровень производства активности антибиотика достигает примерно через 4-7 дней после инокулирования среды для выращивания культуры в случаях применения культур, выращиваемых в аэробных условиях погружения или же в стеклянной посуде, содержимое которой перемешивается при встряхивании. Несколько более длительное время затрачивается при использовании поверхности культуры.

884575

Мицелий и нерастворившиеся остатки удаляют из ферментационного бульона с помощью обычных средств, таких как фильтрование или центрифугирова- ние. Характеризующее антибиотик активное начало содержится в профильтрованном бульоне и может быть извлечено из него путем применения адсорбци нной техники. К числу абсорбентов, которые могут быть применены с наибольшим успехом относятся катионнообменные смолы, например "1КС-50".

Извлекают тенебримицин из ферментационного бульона следующим образом.

Бульон отфильтровывают с применением средства, способствующего фильтрованию, после того, как показатель концентрации водородных ионов РН смеси снижен приблизительно до РН 2 посредством добавления кислоты, такой как. серная кислота, фосфорная кислота, хлористоводородная кислота и подобные им. После этого значение РН фильтрата доводят примерно до РН 5,5 путем добавления концентрированной

-щелочи и смесь снова фильтруют. Полученный фильтрат пропускают через ионообменную колонку, заполненную ионообменной смолой, такой как "IRC50" в аммонийном цикле. Затем колонку промывают дистиллированной водой и активное действующее начало, характеризующее антибиотик, извлекают с адсорбента посредством вымывания разбавленной кислотой.. Фракции, содержащие активное действующее начало, объединяют и концентрируют приблизительно до 1/20 от первоначального объема. Значение показателя РН концентрата повыаают примерно до РН

11 путем добавления концентрированной щелочи, после чего щелочный концентрат выливают примерно в шестикратный объем ацетона, хорошо перемешивают и охлаждают. Выделяющийся осадок, не обладающий активностью в микробиологическом отношении, устраняют с помощью фильтрования.

Значение показателя РН фильтрата понижают приблизительно до РН 3,5 путем добавления 20%-ной серной кислоты при тщательном перемешивании.

Тенебримицин в виде комплекса осаждается в форме сернокислбй соли, в то время как керуломицин, попутно образующийся в процессе ферментации, остается во всплывающем слое, кото- . рый отбрасывается. Сернокислую соль тенебримицина растворяют в минимальном количестве воды и водный раствор пропускают через колонку с

"Доуэксом" 1х1. . Водный раствор сульфата тенебримицина доводят в колонке дистиллированной водой, после чего жидкость, вытекающую из колонки, собирают в виде отдельных фракций ° Активные фракции объединяют и концентрируют до консистенции густого сиропа, затем высушивают с целью получения тенебримицина в виде свободного основания.

Основные факторы, образующие комплекс тенебримицина можно получить, если это желательно, в. виде раздельных антибиотиков посредством дополнительного фракционирования на колонках, заполненных ионообменной смолой тенебримицина. Для проведения фракционирования тенебримицин применяют в виде соли, являяаейся продуктом присоединения кислоты. Пригодной солью является в данном случае сульфат. Раствор сульфата теиебримицина удобно получать посредством приготовления 20%-ного водного раствора тенебримицина с последующей установкой показателя РН раствора приблизительно до РН 4,5 путем добавления серной кислоты. Окрашенные при20 меси можно удалить с помощью перемешивания приготовленного раствора примерно с 56 (весовое количество по, отношению к объемному) активир ванного угля, например "Дарко G-60". Эффективное обеспечение обычно достигают в результате перемешивания сме. си, содержащей автивированный уголь в течение приблизительно часа. После этого смесь фильтруют и фильтрат, который содержит сульфат тенебримнцина помещают в колонку, заполненную ионообменной смолой марки " ИС-50" в аммонийном цикле. Колонку промывают водой, после чего индивидуальные антибиотики, образующие комплекс тенебримицина фракционировано отмывают с адсорбента с помощью 0,1-н. раствора гидрата окиси аммония. Процесс элюирования происходит медленно, и для получения необходимого эффекта фракциони40 рования комплекса обычно необходимо очень большое число фракций. Так, например, полное и законченное фракцнонирование примерно 250 г тенебримицина требует получения около 700

45 фракций, каждая из котоРых содеРжит,ся примерно в 900 мл жидкости,,отмываемой с адсорбента.

Первые из числа полученных активных фракций содержат тенебримицин

50 13 и tl . За ними следуют серии активных фракций, в которых содержится в качестве единственного антибиотика тенебримицин g, . Прежде чем будут открыты фракции, содержащие тенебримицин tV, вслед за элюированием тенебримицина и отходит ряд фракций, не обладающих активностью. Первые фракции, содержащие тенебриь ицин ч, содержат следы тенебримицина а . Тенебрнмицин t7 получают из колонки в

60 составе активных фракций, за которыми следует тенебримицин tV . Для получения тенебримицина Ч колонку дополнительно элюируют более концентрированным раствором гидрата окиси

Ь5 аммония, после того как весь тенебри884575

12 мицин 7 извлечен из колонки. Подходящей жидкостью для отмывки с абсор бента тенебримицина Vl служит 0,3-н. раствор гидрата окиси аммония °

Пример 1. Ферментация 5.tenebrar.ius штамма ATCC 17920.

Спорулированную культуру S.tenebrarius АТСС 17920 получают посредством выращивания организма на модифицированной среде Беннета в виде скошенного агара, имеющего следующий состав, r:

Декстрин 0

Дрожжевой экстракт ("Дифко") 1

Гидролиэованный казеин 2

Экстракт из мяса крупного рогатого скота(".Дифко") 1

CaC l 6Н10 0,01

Промытый агар 20

Деиониэированная вода н количестве, необходимом для доведения объема смеси до 1000 мл

Значение показателя концентрации водородных ионов рН доводят до рН 7 до автоклавиронания.

Скошенную среду засевают спорами St. tenebrarius ATCC Р 17920 и культивируют в отсутствии видимого свеО та в течение пяти дней при 37 С.

Культуру, выращенную на скошенной сре де покрывают водой и наклонную по.-.. верхность осторожно соскабливают, удаляя споры с целью получения водной суспенэии, содержащей споры.Полученную указанным образом суспензию спор применяют для инокулирования среды, имеющей такой состав, Ъ:

Декстроза 0,05

Питательная соевая мука, содержащая 35-45о диспергирующегося протеина 1,5

Декстрин 700 (картофельный)

Декстрин с низким содержанием хлоридов 1

Хлористый калий 0,1

NZ-амин А 0,3

КН Р04 0,05

HgS04 7Н О 0,5

СчС1g- 2Н 0 0,025

Деиониэированная вода 100 мл

Инокулиронанную вегетативную среду инкубиру10т при температуре около

370С в течение 16 ч на аппарате для перемешинания путем встряхивания при одновременном вращении со скоростью

250 об/мин при размахе колебаний б3,2 мм.

Для инокулирования резервуара для посева емкостью 44 л, содержащего вод ную среду следующего состава:

Декстроза 1

Соевая крупа 1,5

КН РО4.0,05

NgS04 0,5

Хлористый калий 0,1

СаС1 -2Н О 0,025, Средство против вспенивания 0,025 применяют порцию вегетативной культуры объемом 50 мл. Среду, находящуюся н резервуаре для посева стерилиэуют при 120 С в течение 30 мин.

Инокулированную среду в резервуаре для посева инкубируют при 37 С в течение 12 ч. Перемешивание со скоростью 370 об/мин начинают немедленно после инокулиронания. В продолжении всего периода инкубирования осуществляют аэрацию при скорости подачи воздуха 0,22 мэ/мин.

К концу периода инкубации содержимое резервуара для посева используют для инокулирования ферментатора емкостью 1,14 м или 0,95 м, содержащего среду следующего состава,Ъ:

Декстроза 4

Соевое масло рафинированное 3

Соевая мука 3

Хлористый аммоний 0,5

Хлористый кальций 0,3

Сернокислый магний 0,2

2Q Азотнокислый аммоний 0,1

ИZ амин-А 0,5

Средство против образования пены 0,23

Депонизиронанная вода

До инокулирования ферментационную среду стерилизуют 30 мин при 120 С. о

Ферментацию проводят при 37 С. Аэрацию осуществляют при скорости подачи воздуха 0,48 м /мин н течение всего период- выращивания,,начиная от инокулирования и кончая сбором выращенной культуры. Перемешивание начинают при скорости вращения мешалки

120 об/мин. Через 12 ч число оборотов мешалки унеличинают до 180. Процесс ферментации продолжают 5 дней. Бульон, содержащий культуру, после пронедения ферментации фильтруют для удаления мицелия и других нерастворившихся твердых веществ. Профильтрован4G ный бульон содержит активность антибиотика при концентрации около

680 ед. в мл.

Пример 2. Изолирование комплекса тейебримицина.

Значение показателя концентрации водородных ионов у 880 л ферментационного бульона, содержащего антибиотик и полученного, как указано в примере 1, понижают приблизительно до рН 2 путем добавления приблизительно 10-15 л 20%-ного водного раствора серной кислоты. К подкисленному бульону добавляют 45 кг средства, способствующего фильтрованию, тщательно перемешивают смесь и фильтруют. Отжатый осадок, оставшийся на фильтре промывают водой и промывные воды добавляют к фильтрату.

Значение показателя рН фильтрата доводят до рН 5,5 посредством добав60 ления 50%-ного водного раствора гидрата окиси натрия. Добавляют примерно 4 кг средства, способствующего фильтрованию, смесь тщательно перемешивают и фильтруют. Полученный фильтр пропускают .через колонку, имею14

13

884575 щую размеры 10,2 смн1,8 м, заполненную ионообменной смолой марки "IRC-50". Колонка имеет слой смолы высо.той 111,7-114,3 см и действует по аммонийному циклу. После того, как весь фильтрат пропустят через колонку, 5 . последнюю промывают дистиллированной водой в количестве около 200 л. Активно действующее начало, характеризуемое свойствами антибиотика затем отI мывают с адсорбента в течение 12-15 ч 10 примерно 150-175 л и 0,1 н. раствора серной кислоты. Элюат собирают в виде фракций по 10 л каждая. Присущая антибиотику активность в составе злюата становится распознаваемой в случае снижения величины водородного по- 1 казателя рН до 4 или несколько менее., По мере продолжения отмывки, водородный показатель элюата продолжает.снижаться до тех пор, пока его значение не достигнет уровня около рН 1,5. 20

Фракции, содержащие активное начало антибиотика объединяют и концентри руют при уменьшенном давлении приблизительно до 1/20 от первоначального объема. 25

Значение водородного показателя рН концентрированного элюата доводят до рН

11 посредством добавления 50%-ного водного раствора гидрата окиси натрия, после чего подщелоченный концентрат добавляют к 6 объемам ацетона. Полученную смесь охлаждают и отставляют в сторону для того, чтобы дать отделиться осадку, лишенному активности, свойственной антибиотику. З5

Затем смесь фильтруют и плотную массу отжатую на фильтре, и состоящую из неактивного осадка, отбрасывают.

Значение водородного показателя рН устанавливают до 3,5 посредством до- бавления, при тщательном перемешивании, 40

20%-ного водного раствора серной кислоты. Во время такой обработки комп.лекс тенебримицина осаждается в виде сульфата. Практически полное осаждение достигается, когда рН раствора достигнет значения около 4 или несколько менее. Смесь фильтруют и фильтрат, содержащий церуломицин, попутно образующийся в процессе ферментации, отбрасывают. 50

Отжатый на фильтре осадок, являющийся сульфатом тенебримицина, растворяют в минимальном количестве воды

;и охлаждают. Все твердые вещества, растворяющиеся более или менее трудно,55 отбрасывают, наряду со всеми твердыМи веществами, выпадающими в виде осадка или кристаллизующимися при охлаждении, прозрачный раствор сульфата тенебримицина пропускают через насадку из ионообменной смолы марки 60

"Доуэкс 1х1" размером 10,2 смх2,1 м.

Раствор антибиотика выводят из колонны с применением 40-50 л дистиллированной воды. Жидкость, выходящую из колонны собирают отдельными фрак- 65 циями по 10 л. Активные фракции объединяют, концентрируют в вакууме до консистенции густого сиропа, который. после высушивания на противне дает сухой тенебримицин.

Пример 3. Сульфат тенебримицина получают путем добавления концентрированной серной кислоты к

20%-ному водному раствору, содержащему 258 г комплекса тенебримицина в виде свободного основания с таким расчетом, чтобы значение водородного показателя рН среды стало равным 4,5. Полученный таким путем раствор сульфата тенебримицина обесцвечивают, перемешивая его примерно один час с 5% (весовое количество по отношению к объемному) активированного угля марки "Дарко 6-60". Затем раствор фильтруют и фильтрат пропускают через колонку размером 9х х105 см заполненную примерно 7 л ионообменной смолы марки "!кС-50" и работающую в аммонийном цикле. После того, как фильтрат, содержащий соль антибиотика, пропустят через колонку, ее про|ывают приблизительно

17 л деиониэированной воды. Вымывание активной части антибиотика, задержанной в колонке начинают с помощью 0,1 н. раствора гидрата окиси аммония, подаваемого со скоростью окало 20 мл в мин. Элюат собирают отдельными фракциями приблизительно по 900 мл, причем каждую фракцию проверяют на микробиологическую активность. Фракции, содержащие одинаковый фактор антибиотика объединяют и высушивают из замороженного состояния с :целью получения индивидуальных высушенных тенебримицинов.

Индивидуальные тенебримнцины распределяются, в зависимости от активности фракций следующим образом (табл.2).

Пример 4. Получение гелиантатов тенебримицинов.

Готовый раствор 2 r тенебримицина ц в 22 мл воды н водородный показатель раствора доводят до значения рН 5 посредством добавления

50%-ной серной кислоты. Затем к раствору антибиотика добавляют горячий

10%-ный водный раствор метил-оранжа.

Гелиантат тенебримицина Й выделяют в виде осадка и отделяют фильтрованием. Твердую соль тщательно промывают горячей водой и высушивают в вакууме. В итоге получают 3,5 г тенебримицин Й гелиантата.

Пример 5. Окончательная очистка факторов тенебримицина.

Готовят гелиантат тенебримицина ui в соответствии с методикой, аналогичной описанной в примере 4.

Четыре грамма приготовленной таким путем соли суспендируют приблизитель1 но в 200 мл воды, значение водородного показателя которой доведено до

16

884575.

1 Н 2 за счет добавления серной кислоты. Смесь перемешивают рколо 4 ч, после чего фильтруют ее через ворон:ку с фильтрующей пористой стеклянной пластинкой средней степени пористости с целью удален@я гелиантовой кислоты. Фильтрам обесцвечивают путем пропускания через тонкий слой активированного угля, после чего пропускают через колонку размером

1х32 см, наполненную ионообмениой смолой "Доузкс 1x2" и работаницую в гидроксильном цикле. Фильтрат замещают в колонке с помощью :дистиллированной воды с целью завершения отмывки активного действующего начала антибиотика. Выходящую из колонки жидкость собирают отдельными фракциями, объединяя вместе активные фракции.:

В заключение производят высушивание в замороженном состоянии. Полученный остаток представляет сухой антибиотик.

Остаток, растворяют приблизительно в 15 мл воды и полученный раствор пропускают через колонку размером 1х х25 см, заполненную ионообменной смолой, "Био Рад смола А9 11AS". Это смола задерживающего действия. Активную составную часть, обладающую свойствами антибиотика, вымывают из колонки дистилированной водой. Активные фракции снова объединяют и высушивают в замороженном состоянии. Вы ход тенебримицина У1 высшей степени очистки — около 700 мг.

Предлагаемый способ позволяет получить новый антибиотический комплекс, который найдет применение в медицине.

884 575 а а о а а an а

СЧ а СЧ СЧ с СЧ

aA N с с, с с N c Q

СЧ а-» aO»» ОР аО а"» aO aA

ln а с сч сч

»-3»-3 to tn сч а».» с СЧ с

»» г» С!Ъ ч

1

I

l

1

I

I

I

I

l !

1

I

I

1

1

1

1

1

1 (с3 ОЪ а tn

О -3 с с (Ч о а о сч N а о

tA (Ч г» »"Ъ»-» а-3 СЧ»(:3 lA

О, 3 tn а с (Ч т»»-» ч а с (Ч

»» N

tA сч с

tO а с (Ч

% 3 о а

lA с (с(%-» %» а с

-3 аО

Ul

lA с-» (Ч ъ/ о о а а

»-» сч сч а о (Ч »А

lA tA а

N СЧ с с СЧ

aO aO т»

О3

tn с а-3 (Ч ч

ОЪ с а (ч о (ч 3 а

1

I

1

I

И

1 ((3

1 Х

I Х

1 C

I С»

1 О! о

I !

I 9

1 э

I Е»

I о

I М

I уоо о

i в х 3

° 133 !» х о о м М

Р, Э х х о о э

X Х О о

Г3 Д а (Г3 о

M и

3й о о в о

Р, о ((Ъ И

Р, а

° о о х Р» Qt

О (33 (33

Ю ej Ю (О О О

Э 9 9

2 И И о

9 Ю Р, в х н

o o x

>Ь >

Х 3." О о о

Э Е» Х

I ttI 9

o r. r о э и

Р, о Х

>ь Х 333

Ю g Ю о р и м в О ю х, л х

ы о о э х о н о

Х з О

\-ч N ° х

a a o и о о

gì м A Х

Х 9

0t 0

Э

Ol д) ° ° v х

o o x о

o v И

» o.

9 .9 4

3Х

I I x

1 I Х 1 ! 1 $ I

1 I $I I

I 1 О

1 1 9 х

1 1 9

1 1 Е» Г 1 х

I Х I I

1 g g I

1 Х !

» 1 l>11

X I ! I 9 1 х

1 Ф 1 9 1

1 5 I ! Ю ! tt!

I Е»! Х

1 Х I Х

I 9 1 «$

1 J 1

О 1 Х111

1 Х 1 Р! I

I 1 О 1

1Х19 ! Ю-1 Х !

Я! Э

I Й l Е» 1

1 > I 1

1й — ро I

1 Х 1 1

1» 1

1 Х 1 Х 1

1 Х 1 ф 1

1 Х 1 Х1=11

1 t(I 1 0» 1

I gI О, I

Е 1 X

I Х Э 1

I Х I Е» I

13I

1 ! !

1 I I

I 1 I

1 I 1

1 I Х I

I х

1 Р!

1 О

1 Э 1 х

1 Э I

1 Е» 1

N ao aO N tA tA

%-» а а»-» с с с с !«с СЧ СЧ с Ъ»-»»-» с Ъ с»».»

v v а аО а СЧ (Ч ОЪ СЧ».» с с с а а

tO»-3 О3 («Ъ N (Ч

lA aO Ю»О (Ч lA ОЪ lA а а

О3 т-3»-»»» (Ч (Ч

v v v а ч> о сч

СЧ ОЪ ОЪ о о (3»-» »»«Ъ in lA

v v

lA aO O IA

СЧ tA. ОЪ N

Оъ а

aO + т» аО 1Ч (Ч ч ч

ОЪ tn ОЪ с с о (ч сч, о сч о

»-3 С а 3»-»

lA (Ч а аА

N с-3 СЧ с с с с а N а

\О С!Ъ tO (Ч т 3 (Ч

tA tA IA lA с с с с (Ч N N an N О Ъ

»-3 -»»-» (с3 «-» (Ч с х

3 о

Ю е о

Ю

2 о

I! х

133 О о

6И

333

3Ц у3 о э 5

884575

Т аб лиц а 2

Фракция

Присутствукщий антибиотик

Не активны

Тенебримицин Z,I и !!

Тенебримицин !!

Не активны

Тенебримицин 6

Тенебримицина!!!

Тенебримицин со следами

173-249

250-256

Не активны

Тенебримицин V

257-634

635-668

Не активны

Тенебримицин Я

669-698

В, ь)

С этого момента элюат изменен до 0,3-н. гидрата окиси аммония.

Формула изобретения

Способ получения антибиотичесого комплекса, содержащего тенебримицин I!p III IV u Ч! и их солей з а к л ю ч а ю шийся в том, что штамм

Streptomyces tenebrarius ATCC 17920 культивируют в глубинных условиях аэробно в питательной среде, содерСоставитель С.Малютина

Техред С.Мигунова Корректор Н.Стец

Редактор Н.Кончицкая

Заказ 10272/89 Тираж 531 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород ул.Проектная,4

1-34

35-53

54-77

78-153

154-172 жащей источники углерода, азота и минеральные соли при температуре 3743 С в течение 4-7 дней, затем выдео ляют целевой продукт в свободном вищ де или в виде его солей, при необходи..мости разделяют комплекс на составные антибиотические компоненты !!, !!!, (, Ч и Я и переводят их в соли.