Способ получения ферментного препарата липоксигеназы

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ЛИПОКСИГЕНАЗЫ путем глубинного культивирования ее продуцентов - плесневых грибов из рода Aspergillus на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода соевую муку, минеральные соли азота, фосфора, калия и магния, с последующим выделением ферментного препарата из культуральной жидкости , отличающийся тем, .что, с целью повышения активности липоксигеназы, культивирование продуцентов осуществляют в присутствии индуктора липоксигеназы - соевого масла в количестве 2-5 мл на 100 мл культуральной жидкости. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование продуцентов липоксигеназы осуществляют на питательной среде, со-. держащей индуктор - соевое масло, соевую муку в качестве источника углерода и минеральные соли - азотнокислый натрий, сернокислый магний, однозамещенный фосфорнокислый калий, (Л взятые соответственно в количествах, вес.: Соевое масло 1-5 8-12 Соевая мука Азотнокислый 00 0,05-0,3 натрий 00 Сернокислый 00 Oi магний 0,005-0,015 Однозамещенный 4 фосфорнокислый 0,05-0,3 to калий Остальное Вода 3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что из рода Aspergillus используют штаммы Aspergillus oryzae 3-9-15 или Aspergtllus awarory - 66,

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН.1(Я) С 12 и 9/02

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

0,05-0,3

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 2949321/28-13 (») 30. 05.80 (46) 15. 08. 83. Бюл, N 30 (72) Р.Р.ТокаРева, Е.A.Двадцатова, И . В, Соло в ье sa, В .Л. Я ровен ко, В.Л.Кретович и E.Â.ÁóäíèöêàR (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт продуктов броже" ния Ордена Ленина институт биохимии им.А.Н.Баха АН СССР и Всесоюзный заочный институт пищевой промышленности (53) 577.15(088.8) (56) 1. Труды Украинского научноисследовательского института пищевой промышленности, т.5,N 21, 1967, с.20-22, ст.Е.А.Калашникова и др. >

"Исследование по получению фермент" ного препарата липоксигенэзы".

2. Технология ферментов, 51

N 3, р. 190-196, 1973, ст..йима ибара и др. "Полимеризация стеринов с использованием липооксигеназного фермента" (54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ фЕРИЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ЛИПОКСИГЕНАЗЦ путем глубинного культивирования ее про" дуцентов - плесневых грибов из рода

Aspergi11us на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода соевую муку, минеральные соли азота, фосфора, калия и магния, с последующим выделением ферментно„„SU„„888542 го препарата из культуральной жидко сти, отличающийся тем, что, с целью повышения активности липоксигеназы, культивирование продуцентов осуществляют в присутствии индуктора липоксигеназы - соевого масла в количестве 2-5 мл на 100 мл культуральной жидкости.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а— ю шийся тем, что культивирование продуцентов липоксигеназы осу. щесТвляют на питательной среде, содержащей индуктор - соевое масло, соевую муку в качестве источника углерода и минеральные соли - азотнокислый натрий, сернокислый магний, однозамещенный фосфорнокислый калий, взятые соответственно в количествах, вес.4:

Соевое масло 1-5

Соевая мука 8-12

А зотнокислый натрий

Сернокислый магний 0,005-0,0 15

Однозамещенный фосфорнокислый калий 0,05-0,3

Вода Остальное

3. Способ по пп. 1 и 2, о т л ич а ю щ и " с я тем, что из рода

Aspergi11us используют штаммы Asper дi11us oryzae 3-9-15 или Aspergi1lus

awarory - 466.

4 88

Изобретение относится к микробио" логической промышленности, а именно к способам получения ферментного препарата липоксигеназы, фермента, используемого в хлебопекарном производстве, Известны способы получения ферментного препарата липоксигенаэы из различных продуктов растительного происхождения (сои, гороха, картофеля} (13.

Недостатком этих способов является низкая активность полученного препарата, дефицит некоторых видов оастительного сырья, в частности сои, необходимост ь создания специальных условий хранения сырья для сохранений активности фермента. Кроме того, использование липоксигеназы, выделенной из растительного сырья, экономически нецелесообразно, так как получение такого фермента очень дорого.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения ферментного препарата липоксигеназы путем глубинного культивирования ее продуцентов — плесневых грибов на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода осевую муку, минеральные соли азота, фосфора, калия и магния, с последующим выделением ферментного препарата из культуральной жидкости, в котором в качестве продуцентов липоксигеназы используют микромицеты из родов

Fusar1um, Aspergi11us, Rhozopus u

Penici11ium (2 ).

Недостатком применения укаэанных продуцентов липоксигенаэы является токсичность некоторых продуцентов, а также очень низкая активность фермента, что не позволило осуществить его использование в промышленности для производства хлеба.

Целью изобретения является повышение активности липоксигеназы.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения ферментного препарата липоксигеназы путем глубинного культивирования ее продуцентов - плесневых грибов из рода

Asperg illus на питательной среде, содержащей в качестве источника уг" лерода соевую муку, минеральные соли азота, фосфора, калия и магния, с последующим выделением ферментного препарата из культуральной

8g42

0,05-0,3

Токсическими и патогенными свойствами штамм не обладает.

Иорфолого-физиологическая характеристика штамма.

Морфолого-культуральные свойства.

Гигантская колония, выращенная на сусле-агаре, на 7 сутки роста имеет диаметр 20-25 мм. форма колонии круглая, размер

20-25 мм.

Цвет колонии темно-зеленый, серозеленый.

Край колонии ровный, плотный.

Центр колонии сильно складчатый, плотный.

Поверхность бархатистая, резко складчатая.

Пигмент отсутствует.

Конидии образуются на 7-е сутки, серо-зеленые до темно-зеленых, форма конидий овальная и круглая, но встречаются грушевидные и эллипсовидные.

Зона гидролиза крахмала есть. физиологические свойства.

45

55 жидкости, культивирование продуцентов осуществляют в присутствии индикатора липоксигенаэы - соевого масла в количестве 2-5 мл на 100 мл культуральной жидкости, При этом культивирование продуцентов липоксигенаэы осуществляют на питательной среде, содержащей индуктор - соевое масло, муку в качестве источни10 ка углерода и минеральные соли азотнокислый натрий, сернокислый магний, одноэамещенный фосфорнокислый калий, взятые соответственно в количествах вес.4:

15 Соевое масло 1-5

Соевая мука 8-12

А зотнокислый натрий

Сернокислый магний 0,005-0,015

Однозамещенный фосфорнокислый калий 0,05-0,3

Вода Остальное

25 Способ отличается тем, что в качестве продуцентов используют штаммы

Aspergillus oryzae 3-9-15 или Aspergillus awamory ч66, Штамм Asperg illus oryzae 3-9-15, Получен путем одноступенчатого воздействия ультрафиолетовых лучей на штамм Asperg illus oryzae. Штамм хранится в коллекции ВНИИгенетика, коллекционный ЦИПКО F 137. !

888542

Потребляет: крахмал, глюкозу, мальтозу, сахароэу.

Ассимилируют нитраты, Отношение к кислороду: аэроб,, максимум роста при 28-30 С, рН 6-7. 5 о

Картофель: на ломтиках картофеля образует белый мицелий.

Штамм Aspergi.llus awamory - 466, Получен путем рассева на сусло- araре исходной культуры. Штамм хранится в коллекции ВНИИгенетика, коллекционный Ю ЦМПИ F 138, токсическими и патогенными свойствами не обладает.

Штамм Asperg i I lus awamory - 466. имеет следующую морфолого-физиологическую характеристику.

Норфолого-культуральные свойства.

Гигантская колония на сусло"агаре. форма колонии — круглая на 12 сутки роста диаметр колонии 39-43 мм.

Цвет колоний белый, желтоватый.

Край колоний неровный.

Поверхность бархатистая, плоская, Пигмент слабо-желтый.

Конидии образуются .на 7-е сутки роста, темно-коричневые.

Эона гидролиза крахмала есть.

Физиологические свойства.

Потребляет: крахмал, глюкозу, сахарозу, мальтозу. 30

Ассимилирует нитраты.

Отношение к кислороду: аэроб, мак" симум роста 37-40 С, pH=5-6 на суслоагаре.

Способ осуществляют следующим образом.

Выращивание продуцентов на данной среде ведут, глубинным методом при аэрации среды и температуре

28-30 С в течение двух суток. В ка- 40 честве посевного материала применяют выращенную на среде того же состава односуточную культуру, высеян" ную с сусло-агара, или же споровую суспензию, полученную смывом с ко- 45

coro сусло-агара. Односуточный посевной материал вносят в количестве 3-5 от объема среды, а споровую суспензию в количестве 1 мл в ферментационную среду того же сос" тава. Культивирование ведут при умеренной аэрации и перемешивании среды при 28-30 С в течение 2 суток. о

Фермент накапливается в мицелии и в культуральной жидкости максималь- 55 но к 48 ч. Аактивность фермента определяют каротиноксидазным методом.

Активность липоксигеназы в среднем составляет 20000-55000 усл.ед. на

1 мл культуральной жидкости. Внекле" точный фермент выделяют иэ культуральной жидкости (после удаления мицелия и неиспользованных остатков осевой муки ) этиловым спиртом на холоду. в соотношении вода:спирт 1:5. Фермент действует в широком диапазоне рН среды - от 4 до В. Оптимум действия при рН 6-7 °

Пример 1. Для получения липоксигеназы используют культуру плесневого гриба Aspergillus or yzae 3-9-15. Продуцент липоксигенаэы выращивают на питательной среде, содержащей 100 мл водопроводной воды, l0 г соевой муки О,1 г NANO>, 0,01 г

MgSO4 7Н20, 0,1 г- КН РО и 2,3 мл соевого масла. В качестве посевного материала используется односуточная глубинная культура, выращенная о при 28-30 С,, Для инокуляции питательной среды используют 3-54 посевного материала ° Продуцент липоксигеназы культивируют при 28-30 С в течение о

48 ч. Активность фермента к концу роста достигает 20000 усл.ед, на

1 мл культуральной жидкости. р и м е р 2. Глубинную культуру

Asperg illus awamory 466 выращивают на питательной среде, состоящей из

12 r соевой муки, 0,2 r NANO» 0,01г

NgSO4 7Н20, 0,015 г КН РО, и 5 мл соевого масла. И аксимум активности фермента 50000 усл.ед. синтезируется к 48 ч роста, при 30-32 С и при аэрации питательной среды.

Пример 3. Использования липоксигеназы при приготовлении теста из пшеничной муки °

Липоксигеназу выделяют из культуры Asper g i l 1 us or yzae 3-9-15; в процессе замешивания теста вводят в количестве 130000 усл.ед. окислилительно-восстановительного фермента липоксигеназы. При этом продолжительность. брожения теста сокращается на 30 мин, продолжительность расстойки - на 10 мин.

Предложенный способ позволяет увеличить объем хлеба до 15-203, пористость до 4-53. Хлеб, приготовленный с применением фермента липоксигеназы микробного происхождения, по сравнению с контрольным хлебом без препарата отличается более нежным и осветленным мякишем, свежесть его сохраняется более длительное вре888542 6 на замена менее активного и более дорогого фермента растительного происхож дения, Ожидаемый экономический эффект от применения изобретения соси- тавляет 180 руб. на 100 т перерабаж- тываемой муки.

S мя, т.е. до 36-48 ч (до 24 ч в конт роле), Таким образом, впервые в мире раз работан способ получения высокоактив ной липоксигеназы микробного происхо дения, в результате чего, стала возмо

Корректор И.Эрдейи

Редактор П.Горькова Техред И.Надь

Филиал ППП "Патент", r Ужгород, ул. Проектная, 4 Заказ 7967/1 Тираж 523 П одписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5