Способ получения мутантов дрожжей, дефецитных по цитохромам и содержащих цианидрезистентную оксидазу

 

/ .

I !

Союз Соеетских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ (»>724575

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнителыное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 12.07,78 (21) 2644576/28-13 (51) М Кл С 12 К1/00 с присоединением заявки №

Государстееииый комитет

СССР (23) Приоритет— (43) Опубликовано 30.03.80. Бюллетень № 12 (45) Дата опубликования описания 30.03.80 (53) УДК 577.15.07 (088.8) по делам иэобретеиий и открытий (72) Автор изобретения (71) Заяв|итель

В. К. Акименко

Институт биохимии,и физиологии микроорганизмов

АН СССР (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МУТАНТОВ ДРОЖЖЕЙ, ДЕФИЦИТНЫХ ПО, ЦИТОХРОМАМ И СОДЕРЖАЩИХ

ЦИАНИДРЕЗИСТЕНТНУЮ ОКСИДАЗУ

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к способам отбора цитохромдефицитных мутантов дрожжей, об разующих цианидрезистентную оксидазу (Endomycopsis, Candida, Rodotorula, Toru1opsis, Endomyces) и может быть использовано в научных биологических исследованиях, в частности при изучении природы цианидрезистентной оксйдазы митохондрий дрожжей и физиологической роли цианид резистентного дыхания для микроорганизмов.

Известны способы отбора цитохромдефицйтных мутантов дрожжей путем получения реплик на плотной среде, содержа щей несбраживаемый источник углерода, например этанол, ацетат (1). Однако отсутствие роста колонии может быть обусловлено отсутствием соответствующей депидрогеназы или другого фермента, участвующе- 20 го в метаболизме этих веществ, но не цитохромов.

Наиболее близким по своей технической сущности к заявленному является способ, согласно которому обработанную мутагена - 2ь ми (ультрафиолет, нитрозометилмочевина, нитрозогуанидин, аюрифлавин и другие) культуру дрожжей рассевают на плотные среды, содержащие сбраживаемые источники углерода и трифенилтетразолийхлорнд, н отбирают бесцветные, неокрашенные формазаном колойии (2).

Такие способы отбора цитохромдефицитных мутантов дрожжей не дают однозначных результатов, поскольку- в случае пересева культуры дрожжей, обработанной мутагенамЫ, на плотные среды, содержащие сбраживаемый источник углерода и трифенилтетразолийхлорид, получают колонии с разной степенью окраски от красной до полностью бесцветной, причем на развитие окраски сказываются не только мутацион ные изменения в культуре дрожжей, но и ингибирующее действие трифенилтетразолийхлорида на цитохромоксидазу.

В связи с вышеизложенным оба имеюп иеся способа отбора цитохромдефицитных мутантов дрожжей обладают недостаточной точностью и специфичностью.

Целью изобретения является повышение точности .и специфичности способа.

Поставленная цель достигается тем, что из образовавшихся при рассеве на твердой питательной среде колоний микроорганизмов отбирают петитные варианты и выращивают их на жидкой среде со сбраживаемым источи|иком углерода, а отбор мутантов осуществляют по признаку подавления дыхания после добавления ингибитора циа724575

25

50

Изд. № 193 Тираж 522 Подписное

Заказ 109/179

11ПО «Поиск»

Тип. Харьк. фил. пред. «Патент»

13 нидрезистентной оксидазы к суспензии мик. роорганизмов.

Сущность изобретения состоит в том, что культуру дрожжей, способную к образованию цианидрезистентной оксидазы (Endomyces, Candida, Rhodotorula, Torulopsis, Endomycopsis) обрабатывают мутагенами, например акрифлавином, этидиумбромидом, ультрафиолетовым облучением и рас,, севают на плотную среду, содержащую сбра жив аемый источник углерода. Через

40 — 48 ч отбирают петитные колонии и пере- . севают на жидкую среду, содержащую также сбраживаемый источник углерода. Через

10 ч роста проводят полярографическое измерение дыхания в присутствиями ингиби-. тора цианидрезистентной оксидазы, например салицилгидроксамовой кислоты, бензгидроксамовой кислоты или их галоидпроизводных. Так KBK IIHBHHppe3HcTeHTH38 оксидаза — единственная оксидаза митохондрий у этих цитохромдефицитных дрожжей, культура дрожжей, у которой в этих условиях полностью отсутствует дыхание, является мутантом, дефицитным по одному или нескольким цитохромам.

Изобретение отличается от существующих способов .отбора цитохромдефицитных мутантов дрожжей тем, что используются специфические ингибиторы цианидрезистентной оксидазы на стадии измерения дыхания культур петитных колоний.

Пример. Односуточную культуру дрожжей Candida parapsilosis выращенную на косяке с сусло-агаром, смывают 5 мл стерильной дистиллированной воды и вносят в колбу объемом 750 мл, содержащую

100 мл среды Ридер с 0,2% дрожжевого экстракта и 1% глюкозы. Дрожжи выра-щивают на качалке (200 об)мин) при 28 С до ранней стационарной фазы роста. Полученную культуру дрожжей засевают по 5 мл в колбу с той же средой и вносят стериль ный раствор акрифлавина (500, 600, 700, 800, 900, 1000 мгlмл), Дрожжи выращивают в течение суток и полученную биомассу .из каждой колбы разводят стерильной водопроводйой водой в 10, 100, 1000, 10 000, 100 000,раз. Отбирают из каждбго разведения по 0,05 мл и рассевают на чашки Петри с агаризованной средой следующего состава, г/л: MgSO4

0.,5 Н О 7, (NH4) 2SO4 1,5) КН РО4 1,0; пептон 1,8; дрожжевой экстракт 2,0; глюкоза 10, агар 20.

Чашки помещают в термастат на двое суток при 28 С и через двое суток каждую петитную колонию петлей переносят на ко сяк с сусло-агаром. В одном опыте можно отобрать до 300 петитных колоний.

Через сутки часть культуры дрожжей с косяка засевают в колбу с жидкой средой и через 10 ч измеряют степень торможения дыхания культуры дрожжей бензгидроксамовой кислотой. Для этого в полярографи-, ческую ячейку вносят 1,5 мл среды, содержащей 10 мМ трис-фосфатного буфера (рН 5,5) и О,б мл культуры дрожжей, взятых непосредственно из колбы. 100%-ное подавление дыхания 5 — 10 мМ бензгидроксамовой кислотой указывает, что мутантлишен цитохромов.

Среди отобранных петитных колоний (около 300 штук) со 100%-ньгм торможе15 нием дыхания бензгидроксамовой кислотой выявлено 2 мутанта; 25 культур обладали частичной чувствительностью к бензгидроксамовой кислоте. Дыхание остальных мутантов не подавлялось бензгидроксамовой

20 кислотой.

В настоящее время получение цитохромдеф|ицитных мутантов представляет большой интерес как один из подходов к изучению природы и физиологической роли циа25 нидрезистентной оксидазы для микроорга н измов, поскольку природа цианидрезистентной оксидазы митохондрий дрожжей не известна.

Формула изобретения

Способ получения мутантов дрожжей, дефицитных по цитохромам и содержащих цианидрезистентную оксидазу; предусматривающий обработку исходной дрожжевой культуры мутагенами, ее рассев на твердую питательную среду, содержащую сбраживаемый источник углерода, и последующий отбор, отличающ,ийся тем, что, с целью повышения точности способа, из образовав1пихся на твердой питательной среде колоний микроорганизмов отбирают петитные варианты и выращивают их на жидкой среде со сбраживаемым источником углерода, а отбор мутантов осуществляют по признаку подавления дыхания после добавления к суспензии. микроорганизмов ин гибитора цианидрезистентной оксидазы

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе;

1. Э. Lloyd. The mitochondria.of microorganisms. — Academic, Press, 1974, 55- рр 285 — 367

2. М. Ogur, R. S. Tohn, S. Nagai. Tetrazolium overlay technique for population

studies of respiration deficiency in glast.—

Science, 1957, со1. 125, рр. 928 — 929.