Способ отбора микроорганизмов,содержащих рекомбинантные молекулы днк

 

ОП ИСАЙ ИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскик

Социалистические

Республик е

<»>912754 (6I ) Дополнительное к авт. свид-ву (22)Заявлено17.06.80 (21) 3000534/30-15 с присоединением заявки,% (5l) M. Кд.

С 12 Я 15/00

3Ъеударотееииый комитет

СССР ио делам изобретений и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 15.03 ° 82 Бюллетень № 10 (53) УДК 576.8. . 078 (088. 8) Дата опубликования описания 15. 03. 82 (72) Авторы изобретения

Н.П. Кузьмин, А.С ° Солонин, В.И. Таняшин; и,А.А. Баев

4

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов AH CCCP " (7! ) Заявитель (54) СПОСОБ ОТБОРА МИКРООРГАНИЗМОВ, СОДЕРЖАЩИХ

РЕКОМБИНАНТНЫЕ МОЛЕКУЛЫ ДНК

Изобретение относится к области молекулярной биологии, а именно к от,бору клеток микроорганизмов с измененными .генетическими признаками в работах по генной инженерии. Микроорга низмы, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК с чужеродными генами, сконструированные in vitro - проду- . центы различных биологически активных веществ, могут быть использованы в

10 микробиологической промышленности.

Известен способ отбора бактериаль.ных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, по их способности расти на питательных средах, содержа15 .-. щих антибиотики (1 ).

Согласно известному способу трансформированные рекомбинантными молекулами ДНК клетки микроорганизмов при помощи шаблона высевают на две чашки

Петри с твердой питательной средой, каждая из которых содержит один из антибиотиков. После высева бактериальные клетки выращивают в течение

12-24 ч. Сравнивают результаты роста на обеих чашках и отбирают те клоны микроорганизмов, которые способны расти только на среде с одним из антибиотиков. Если в качестве век. тора применяют плазмиду рВ 322, то каждый из отбираемых клонов трансформантов высевают на твердую питательную среду с ампициллином и тетрациклином (обычно используемые концентрации антибиотиков колеблются от 10 до 50 и более мкг/мл). Так,векторная плазмида pBR 322 придает клеткам резистентность к ампициллину и тетрациклину. Поэтому бактериальные клетки, содержащие исходный вектор, вырастают на обеих чашках, содержащих как ампициллин, так и тетрациклин.

Клетки утрачивают устойчивость к ам" пициллину при введении чужеродной ДНК в состав вектора по сайтам оестрикции эндонуклеаз Pst I или Pvu I.. При этом клоны клеток, содержащие такие рекомбинантные молекулы ДНК, в отличие от

Однако существующие методы отбора бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, осуществляются химическими агентами такими, I

20 как антибиотики, что повышает их воэможную биологическую опасность для окружающей среды. Использование не скольких антибиотиков при селекции рекомбинантов увеличивает продолжительность операций при подготовке селективных сред. При использовании этого метода в промышленных масштабах возникают существенные трудности точное дозирование антибиотика, внесение в питательную среду после стерилизации, инактивация антибиотика .

35 в процессе хранения в составе среды, высокая себестоимость некоторых антибиотиков, разрушение антибиотиков в процессе культивирования за счет выделения в среду ферментов, дегра40 дирующих антибиотики, таких как

Ъ-лактамаэа..Целью изобретения является упрощение. способа отбора клеток микроор-, ганизмов, содержащих рекомбинантные

ДНК, и уменьшение его биологической опасности.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу отборки микроорганизмов, содержащих рекомбинант" ные молекулы ДНК, включающему пересев микроорганизмов по шаблону на поверхность твердой питательной. среды, инкубацию и отбор клонов микроорганизмов на основании сравнения с контролем перед инкубацией микробны клетки подвергают ультрафиолетовому облучению, а клетки клонов микроор3 912 5 клеток, содержащих исходный вектор, растут на среде с тетрациклином и не растут .на среде с ампициллином. Это является фенотипическим признаком для отбора клеток с рекомбинантными молекулами ДНК..

Иаркер устойчивости к тетрацикли1 ну инактивируется при интеграции чужеродной ДНК в сайты рестрикции эндонуклеаз Н пй!!1, Вав !Н1, За! .Транс- я формированные такими рекомбинантными молекулами ДНК клетки растут íà среде с ампициллином и не растут на среде с тетрациклином, что и йомогает отличить их от клеток, транс- 15 формированных исходным вектором. Такие векторные молекулы ДНК называют векторами инсерционной инактивации. ф ганиэмов отбирают с того места контроля, где клетки опыта погибли.

Пример 1, Клоны клеток получают после трансформации компетентных клеток Е.cori НВ 101 .чесА смесью сшитых с помощью полинуклеотидлигазы Фага Т4, Feodal-фрагментов ДНК Фага

Т4 с расщепленной эндонуклеазой Есор!

ДНК векторной молекулы рХ13.

Полученные клони клеток пересевают на поверхность твердой питательной среды, содержащей 10 г бакто"триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 r

NaCE, 15 г бакто-агара на 1000 мл воды, с помощью шаблона. Пересев делают одновременно на две чашки Петри, после чего поверхность питательной среды одной чашки облучают Уф-светом; (опыт). Клетки, высеянные на вторую, чашку, воздействию УФ-света не под- вергают (контроль). В качестве источника Уф-света (Л -254 нм) используютд ба ктерицидную лампу БУФ-15, nporpeTye перед опытом в течение 30-45 мин, высот : между поверхностью,на которой находят - ся клетки, и УФ-источником 40 см, время воздействия УФ-света 60 с.

После УФ-облучения выращивают клетки без воздействия видимого све" та (полная темнота). Для этого после облучения чашки Петри (опыт) сразу помещают в светонепроницаемый контейнер (конверт из черной бумаги, ящик. и т.п ° ) и выращивают в полной темноте 24 ч, После появления видимых ко" лоний клеток сравнивают соответствие роста каждого клона клеток 8 контро" ле и опыте. На поверхности питательной среды обеих чашек Петри (конт,роль и опыт) вырастают клетки, содержащие исходные векторные молекулы

ДНК, с ненарушенным геном Уф-устойчивости. Вырастают на контрольной чашке

Петри и отсутствуют в опыте (не вырастают) клоны клеток, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК, в ген устойчивости к УФ-облучению которых произошла вставка чужеродного фрагмента ДНК.

Сущность явления заключается в том, что в качестве генетического . маркера, по инактивации которого происходит отбор рекомбинантов, исполь- зуют чесА ген Е, со- Ei. Сайт расщеп« ления эндануклеазы Есо Р1 находится

s структурной части этого гена. Таким образом, интеграция чужеродного фрагмента ДНК в Есо Ri ñàéò вектор2754 6

Преимуществами предложенного способа отбора микроорганизмов,содержащих рекомбинантные молекулы..

ДНК, без использования антибиотиков являются упрощение способа за счет использования физических факторов (УФ-свет) взамен химических факто= ров; биологическая безопасность для окружающей среды микроорганизмов с

1в рекомбинантными ДНК; упрощение соста- ва питательной среды за счет отсутст вия антибиотиков.

Формула изобретения

Составитель А.Макаров

Редактор Л. Веселовская Техред И. Надь Корректор С. Шекмар

Заказ 1316/35 Тираж 505 - Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 91 ной молекулы ДНК ведет к инактивации (нарушению) гена, что фенотипически проявляется в исходной Уф-чувствительности трансформированных клеток.

Если встройка чужеродной ДНК в

EcoRl"ñàéT векторной молекулы ДНК отсутству т, ген УФ-резистентности функционирует и обеспечивает выживаемость клеток после облучения.

Пример .2. Аналогичным спо". собом отбирались клетки, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК, создан" ные на основе векторной молекулы

ДНК рХ15, где при встраивании чуже. родного фрагмента ДНК инактивирует- 1

:ся ген .УФ-устойчивости из Proteus

mi rabi Pis. Ген устойчивости к ультрафиолету Ргойецз я1гаЬ! Ь з имеет другую (отличную от чес А гена

Е coll) первичную структуру ДНК,кото- щ рую определяют наличием сайтов рас: щепления для других эндонуклеаз рестрикции, в которые возможна интегра.ция чужеродного фрагмента ДНК,приводящая к нарушению гена УФ-устойчивости. Рассмотренный в примерах спо1 соб отбора на основе инсерционной инактивации генов позволяет конструировать новые векторы, так как эти. гены имеют отличную первичную струк- .30 туру ДНК и, тем самым, увеличивают число рестрикционных. эндонуклеаз, применяемых при конструировании in

:vitro рекомбинантных молекул ДНК.

Способ отбора микроорганизмов,содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, включающий пересев микроорганизмов.. по шаблону на поверхность твердой питательной среды, инкубацию и отбор клонов микроорганизмов на основании сравнения с контролем, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения способа и уменьшения его биологической опасности, перед инкубацией клетки микроорганизмов подвергают ультрафиолетовому облучению, а клетки клонов микроорганизмов отбирают с того места контроля, где клетки опыта погибли.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. F. Bolivar etaE, Gene, 2, 1977, р. 95-113 °