Способ культивирования бактерий

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскии

Социвлистическик

Республик ()939546 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22)Заявлено 05.06.80 (21) 2938125/30-15 с присоединением заявки М (23) Приоритет

Опубликовано 30. 06. 82. Ьтоллетень ¹ 2"

Дата опубликования описания 30 .06 .82 (5t}NL. Кд.

С 12 N 1/06 е ооударстоеииый комитет

СССР по долам изабретеиий и открытий (53) УДК63.576. .8(088.8) (72) Авторь1 изобретения

P. Х. Сагиров, Б. В. Сергеев, Д. М. Исакова, В. 10. Ракитин, Н. В. Прокофьева, Л.. И. Песко

М. П. Вишникина и В. Н. Давыдов

Всесоюзный научно-исследовательский проектно конструкторский институт прикладной био (71) Заявитель (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способов культивирования бактерий как для производственных, так и для ис следовательских целей.

Известно, что для максимального

5 накопления биомассы и продуктов жизнедеятельности любых микроорганизмов, в том числе бактерий, последним должны быть созданы благоприятные условия развития, включая сбалансированный состав источников питания, обеспечивающий физиологические потребности культуры или максимальное накопление требуемых продуктов их метаболизма.

9дним из путей решения этой задачи является повышение эффективности использования бактериями природных субстратов растительного или живот- то ного происхождения. С этой целью природные субстраты подвергают процессу кислотного или ферментативного гидролиэа и в среду как источник пи2 тания вносят соответствующий гидро- лизат.

Известны способы культивирования бактерий, предусматривающие выращивание организмов как на средах, содержащих в качестве источника азота гидролизаты белкового материала, так и на средах, содержащих в качестве источника углерода гидролизаты углеводсодержащего сырья (1 ) и 1.2).

В большинстве случаев недостающий источник питания, вводимый в среду, представляет собой индивидуальный сахар, чаще всего глюкозу, когда среда содержит гидролиэат белкового материала, или негидролиэованный источник азота, если среда содержит гидролиэат углеводсодержащего сырья.

Известен способ культивирования энтомопатогенных бактерий, заключающийся в выращивании микроорганизмов на среде, содержащей гидролизат белоксодержащего материала, негидро939546

3 лизованный источник углеводов и свободные сахара 131.

Недостаток известного способанеобходимость использования гидрола, являющегося отходом производства и поэтому продуктом нестандарт ным, а также ограничено доступным.

Кроме того, присутствие в среде негидролизованного источника углерода (кукурузной муки) и свободных углеводов (гидрола) удлиняет цикл. развития культуры за счет явления диауксии и двухфазного роста.

Цель изобретения - интенсификация развития бактерий.

Поставленная цель достигается эа счет того, что в качестве источника углерода используют полностью гидролизованный углеводсодержащий материал.

При этом энтомопатогенные бактерии типа Вас|llus thuringiåïsls культивируют на среде, включающей гидролизат кукурузной муки 0,3-2,5i (по редуцирующим веществам) и гидролизованный на 24 БВК 40-90 мг3 (по аминному азоту).

Иолочно-кислые бактерии типа

LactabaciIlus acidophiIIus культивируют на среде, включающей гидролизат зо кукурузной муки 0,5-2,03 (по редуцирующим веществам) гидролизованный на 1004 БВК 100-1000 мг i (по аминному азоту) и К НРО 0,3-0,64.

Источник углерода должен быть гидролиэован полностью, чтобы исклю- з чить задержку развития культуры вследствие диауксии. Белоксодержащее сырье должно быть гидролизовано на 2-100 в зависимости от особенностей выращиваемой культуры. Допустимо использовать как кислотные, так и ферментативные гидролиэаты.

Конкретное соотношение источников углерода и азота зависит от физиологических потребностей бактерий и характера метаболических процессов.

Предлагаемый способ заключается в следующем.

Предварительно готовят гидролизаты белоксодержащего и углеводсодержаще- в го сырья. Углеводсодержащее сырье гидролизуют полностью, а белоксодержащее сырье - в зависимости от известных потребностей используемой культуры бактерий. Если, например, культура требует на начальных стадиях развития относительно высоких концентраций источника азота - ис4 пользуют гидролизат белоксодержащего материала более высокой степени расщепления. На основе приготовленных гидролизатов готовят среду для культивирования бактерий, исходя из известных потребностей культуры в источниках азота и углерода. При необходимости в состав среды могут быть введены дополнительные компоненты. Среду стерилизуют обычным образом и осуществляют на ней кул ьти вирование требуемой культуры.

Пример 1. На основе предварительно приготовленного гидролизата кукурузной муки, гидролизованной до полного расщепления, углеводов и гидролизата белково-витаминного комплекса (ВБК), гидролизованного на

2 ., готовят среду следующего соста2 ва:

Гидролизат кукурузной муки 1,5 вес.Ф

Гидролизованный на 24 БВК До конечноного содержания аминного азота

70 мгб (по аминному азоту)

Вода До 1 л

Среду стерилиэуют. при О,7 ати в течение 30 мин и стерильно разлива" ют в колбы. Среда имеет рН 7,0 +0,2.

Посевной материал — культура 8ас.

thur ing lens Is var dendrol imus которую выращивают на агаровой среде в течение 3 сут, смывают клетки стерильной водой и вносят в культуральную среду в коли че ст ве 2 об. 4.

Культивирование проводят на качалке при 450 об/мин при 30+1 С. Процесс ферментации составляет 28 ч. При этом наблюдается синхронное спорокристаллообразование. Титр культуральной жидкости составляет 5,6 млрд. спор/мл.

По сравнению с известным способом достигнуто сокращение времени культивирования на 10 ч без снижения конечного титра культуральной жидкости.

Использование предлагаемого состава среды повышает экономичность процесса, так как среда является . более дешевой и содержит более низкое коЛичество сухих нерастворимых веществ, обеспечивая снижение потерь целевого продукта на этапе его выделения.

5 9395

Готовят плотную следующего состаПример2. питательную среду ва:

Гидролизат кукурузной му ки

До конечного содержания в сре- 5 де редуцирующих веществ 0,3 вес.4

Гидролизо- До конечного сованный на 2i держания в среде

БВК 60 мгФ аминного 1о азота

Агар 2 вес.3

Среду стерилизуют при 1,2 атм в течение 20 мин, и разливают в чашки

Петри. Среда имеет рН 7,1. 15

На среду петлей высевают культуру Вас. thuringiensis ч. kuzstaki из лиофилизированного состояния. На среде вырастают крупные колонии в

P-форме с сильно складчатой (морщи- 2о нистой) поверхностью. Микроскопическое исследование культуры различного возраста показывает наличие однородных по форме и размерам клеток, которые одинаковым образом окрашиваются. Процесс споро- и кристаллообраэования у культуры отличается синхронностью и заканчивается за

3 сут.

Параллельный высев культуры на ао общепринятую среду (ИПА) при водит к изменению морфологических и культуральных свойств, к нарушению синхронности споро- и кристаллообраэования, к удлинению цикла развития кле- з ток до 6-7 сут, к появлению "бескристаллических" форм культуры, что в общем характеризует признаки ее вырождения.

Пример 3. Готовят питательную среду следующего состава:

Гидролизат До конечного кукурузной содержания рему ки дуцирующих веществ 1,5ь

Гидролизо- До конечного сованный на 100 держаний аминБВК ного азота

150 мг3

К Н Р 0,1. 0,5 0

Вода До 1 л

Среду стерилизуют при 0,7 атм в течение 30 мин. Среда имеет рН 6,6.

Среду засевают суточной культурой

Lactobac. acidophillus, предварительно выращенной на молочной сыворот- . ке, и культивируют без аэрации, но прН периодическом перемешивании в течении 18 сут. Путем добавления ра-.

46 6 створа едкого натра поддерживают в процессе культивирования рН 6,7.

Полученный титр культуральной жидкости составляет 2,2 млрд/мл.

Параллельное выращивание культуры на обычно используемых средах приводит к достижению титра на уровне

0,8 млрд/мл.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет сократить срок выращивания бактерий, беэ снижения конечного титра культуры или повысить титр бактерий при той же длительности культивирования. Одновременно достигается упрощение способа за счет использования практически двухкомпонентных сред, снижение расхода питательных компонентов за счет более полной их утилизации оказывается возможным сократить расход пищевых продуктов (в частности, глюкозы) для выращивания бактерий.

Формула изобретения

1, Способ культивирования бактерий, включающий их высев на среду, содержащую источник углерода и источник азота в,виде гидролизата белоксодержащего материала, о т л и ч а юшийся. тем, что, с целью интенсификации процесса, в качестве источ-. ника углерода используют полностью гидролизованный углеводсодержащий материал.

2. Способ культивирования энтомопатогенных-бактерий типа Bacillus

thuringiånsis по и. l о т л и ч а юшийся тем, что культивирование проводят на среде, включающей гидролизат кукурузной муки 0,3-2,53 (по редуцирующим веществам) и гидролиэованный на 23 БВК 40-90 мгФ (по аминному азоту).

3. Способ культивирования молочнокислых бактерий типа Lactobaci11us

acidophi1lus no n. 1, ч а ю шийся тем, что культивирование проводят на среде, включающей гидролизат кукурузной муки 0,52,03 (по редуцирующим веществам),, гидролиэованный на 100Ж БВК 1001000 мгФ (по,аминному азоту) и

К "P0А 0,3-0,63.

939546

Составитель М. Дранишников

Редактор Л. Филь Техред N. Tenep

Корректор g шароши

Заказ 4599/40 Тираж 505

ВНИИПИ Государственного комитета CCCP по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, N-35, Раушская наб., д. 4/5 г

Подписное филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство ЮСР

Ф 582282, кл. С 12 И 1/06, 1974.

2. Авторское свидетельство СССР и 458575, кл. C 12 8 3/08, 1973.

3. Авторское свидетельство СССР по заявке М 2777387/30-15, 1979

S (прототип).