Способ очистки микробных липаз методом аффинной хроматографии

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 16. 08. 79 (21) 2818836/28-13 (51) M. Кд.з

С 12 Н 9/18 с присоединением заявки ¹(23) Приоритет

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 5 77.15..07(088.8) Опубликовано 1507.82. Бюллетень ¹ 26

Дата опубликования описания 15. 07 . 82 (72) Авторы изобретения

Н.Н.Лестровая, Ж.Д.Лебедева, И.

В.У.Букбарде, И.В.Грузин (71) Заявители

Научно-производственное объеднне и Институт микробиологии AH СССР (54) иктодои ввфинной хРОмлтОГРлфии

Изобретение относится к способу очистки липаз (триглицеридгидролаэ, КФ 3.1.1.3), которые находят применение в пищевой и медицинской промышленности, в производстве моющих и косметических средств, при дублеHHH кож (обезжиривание), для удале.ния смазки в прецизионном инструменте,.в лабораторной практике (например, для определения структуры глицеридов). Очищенные липаэы могут быть также использованы как высокоспецифические катализаторы в тонкой хи»лической технологии для гидролиза масел и жиров.

Известны способы очистки липаз, котОрые представляют собой комбинации стандартных методов очистки ферментов вообще, В последние годы находит все большее распространение эффективный метод аффинной хроМатографии для очистки липаз, основанный на использовании специфического свойства этих ферментов - их гидрофобности и заключающийся в адсорбцик фермента на нерастворимом сорбенте, представляющем собой нерастворимую матрицу с присоединенным лигандом, способным. специфически связываться с ферментом за счет гидрофобного взаимодействия, и последующей десорбции фермента с сорбента.

Известен способ очистки микробных липаз методом аффинной хроматографии, включающий сорбцию фермента иэ раствора на аффинном сорбенте при рН 7-8 и десорбцию фермента с помощью органического растворителя н детергентов, причем испольэуеьый сорбент представляет собой органическую матрицу - сефарозу 4В, в которой присоединен лиганд — алифатический, алициклический или гетероциклический амин, обуславливающий гидрофобные свойства сорбента. В качестве исходного ферментного раствора используют культуральную жидкость Pseudomonas mephitica var (ipofytica. Десорбцию адсорбированного Фермента проводят с помощью растворов солей желчных кислот, анионных поверхностно-активных веществ, органических растворителей, смешивающихся с водой. Наилучшими десорбентами являются 0,5%-ный тритон х=100, 0,5%-ный твин 80, О,ЗЪ-ный натрий лаурилсульфат, смесь ацетон — 0,1 М 1}аНСОо (i!1) с добавлением 0,5 М в}аСк. Йа этапе аффинной. хроматографии достигают очистки фер943278 мента в 2-5 раз, удельная активность возрастает до 160 ед. Выход 50-78% от активности исходного материала (13 .

ОднакО способ характеризуется невысокой степенью очистки и недостаточной устойчивостью органической матрицы сорбента к влиянию среды и действию микроорганизмов, что приводит к загрязнению выделяемого фермента продуктами разрушения матричного материала. 1О

Цель изобретения — повышение степени очистки ферментов.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу" очистки микробных липаз путем аффинной хроматогра- 15 фии, включающим сорбцию фермента из раствора на аффинном сорбенте при рН 7-8 и десорбцию фермента органическим растворителем и детергентами, используют сорбент, представляющий ( собой:силохром с нанесенным полимерным покрытием из сополимера 2,2-ди-(4-эпоксипропилоксифенил}-пропана и поливинилового спирта и присоединенных с помощью гексаметилендиизоцианата Cg-С 0 -алкильных групп.

Используют 0,05-0,2 мг.экв/г сорбента с содержанием С -С 0 -àëêèëúíûõ групп.

Десорбцию фермента обычно проводят 50%-ным раствором этиленгликоля, 0,5%-ным раствором дезоксихолата натрия, 0,1-0,6%-ным раствором тритона х-100.

Предлагаемый способ обеспечивает 35 повышение степени очистки ферментов до 13-23 раз.

Повышение степени очистки обусловлено высокой избирательностью адсорбции ферментов на сорбенте, который 4О содержит лиганды — гидрофобные алкильные группы, а также гидрофобные группировки молекул эпоксидной смолы, поливинилового спирта и гексаметилендиизоцианата, по отношению к которым липаза проявляет свою аффинность. Высокая степень гидрофобности сорбента, усиливающая гидрофобное взаимодействие фермента с сорбентом,увеличивает адсорбцию липазы.

Кроме того, сорбент на основе неорганической матрицы обладает структурной стабильностью (такие носители мало чувствительны к изменениям рН и других условий среды и не изменяют своих .размеров и конфигураций, т.е. являются механически прочными), устойчивостью к действию микроорганизмов, легкостью модификаций, доступностью и сравнительно- низкой себестоимостью. бО

-Используемый в предлагаемом способе аффинный сорбент представляет ,собой фактически модифицированный силохром, который получают пропиткой силохрома 1-30%-ной эпоксидной 65 смолой в растворе ацетона и последующим выпариванием растворителя, отверждением смолы 3-5%-ным водным раствором поливинилового спирта в присутствии 1-2% триэтиламина при весовой соотношении силохрома и раствора 1:5-10 и 90-95 С и послЕдующей активацией .материала 5-20Вным раствором гексаметилендиизоцианата в сухом толуоле при весовом соотношении твердой фазы 1г4-6 и

105-110 С в течение 1 ч и присоединением лиганда обработкой полученного материала алифатическим спиртом с числом углеродных атомов

Cg-С при весовом соотношении матрицы и спирта 1:3-6 и 100-105оС

Пример 1. Получение сорбента.

В колбу загружают 20 г силохрома и раствор 1 r эпоксидной смолы в

70 мл ацетона. Систему подключают к вакууму на 1-2.мин для удаления воздуха из пор носителя. После выпаривания растворителя добавляют

200 мг 5%-ного водного раствора поливинилового спирта, 2 мл триэтиламина и нагревают на водяной бане при 90-95 C в течение 1 ч. Фильтруют, промывают горячей водой, ацетоном и сушат.

К полученному продукту добавляют

80 мл 10%-ного раствора гексаметилендиизоцианата в сухом толуоле и перемешивают при 100-1100С в течение

1 ч. Фильтруют, промывают на фильтре толуолом и.сушат в вакуум-сушильном шкафу. Содержаийе иэоцианатных групп 0,06 мг экв/г.

Активироваиный силохром загружают в колбу с 80 мл амилового спирта и перемешивают при 100-105 С в течение 1 ч. Фильтруют, промывают этайолом и сушат. Содержание амиловых групп приблизительно 0,05 мг.экв/г.

Так как алкильные группы не поддаются прямому определению, то их содержание определяется из расчета, что степень превращения изоцианатных в алкильные около 80%.

Пример 2. Очистка липазы на сорбенте с октиловой группой с применением при десорбции ступенчатого градиента концентрации тритона х-100.

Приготовление исходного ферментного препарата.

Исходным материалом для очистки служит ферментный препарат, полученный осаждением сульфатом аммония белков иэ культуральной жидкости макроскопического гриба Jeotrichum

asteraides, выращеииого.на питательной среде в течение 48 ч при аэрации и 28 С. Препарат имеет активность 14-21 ед/мг белка. 3а единицу липолитической активности принимают количество фермента, освобождающее 1 мкмоль олеиновой кислоты за 1 мин при 37 С.

943278 тивности определяют по разности со-держания белка и активности в исходном материале и в фильтрате, полученном после отделения частиц но» сителя с адсорбированньм ферментом.

Адсорбированный фермент злюируют (фракции по 3 мл) по следующей схеме: 50%-ный раствор этиленгликоля 15 мл1 0,5%-ный раствор дезоксихолата натрия 15 млу тритон х-100:

:О, 1%-ный раствор 9 млу 0,2%-ный 12 мл; 0,4%-ный 12 млу 0,6%-ный

l2 млу 0,8%-ный 12 мл °

Активность липазы

Белок

Этапы очистки

Удельная, ед./мг белка

Исходный ферментный р-р

356 100,0

16 4 100,0 21,0

Адсорбировано на носителе

76,4

272

37,0

6,0

Десорбция,%

2,5

Этиленгликоль

7,5

8,5

0,5

Деэоксихолат натрия

0,3

2,5 l

4,0

0,7

3,0 285,0 134

3,0 237,5 94

1,3 198,5 25

1,0 73, 0 9

Тритон х-10(г"

37,6

0,1 0,5

0,2 0,5

26,4

0,4

7,0

0,2

2,5

0,6 0,1

0,8 0

3,4 21,0

76,3

272

Выход

"Белок и активность прн десорбции выражены в процентах от белка и активности исходного материала. Удельная активность представлена по наиболее активным фракциям.

Величины активности даны с учетом влияния разных концентраций тритона х-100 на активность липазы.

Тритон х-100 в концентрации 0,10,2% десорбирует 84% липазы с очист- 60 кой в 11 раз, в наиболее активных фракциях в 13 раз.

Тритон х-100, оказывающий на липа,эу ингнбирующее действие в концентрации 0„013% и выше, удаляют ультра- 65

К 400 мг сорбента (октилсилохрома) добавляют 4 мл ферментного раствора (365 ед.) a 0,01 M фосфатном буфере (рН7,2). Смесь оставляют при 20 С на 2 ч, периодически встряхивая, после чего частицы сорбента с адсор- 5 бированной липазой помещают на колонку (10 мм в диаметре) и сорбнруют фильтр . Сорбент с адсорбированным ферментом промывают фосфатным буфером до изчезновения белка в прови-; p вных водах. В фильтрате определяют липолитическую активность по методу

Ота и Ямада, а также белок по методу Лоури в модификации Хартри. Количество адсорбированного белка и акРезультаты элюирования представлены в таблице. фильтрацией через мембрану РИПОР-4 (Олайне) при добавлении к ферментному раствору глицерина.

Пример 3. Очистка липаэы на сорбенте с октиловой группой с применением при десорбции непрерывного градиента концентрации тритона х-100

943278

Формула из обретен ия

ВНИИПИ Заказ 5037/34 Тираж 505 Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Исходным материалом для очистки служит Ферментный препарат, полученный осаждением сульфатом аммония белков из культуральной жидкости микроскопического гриба Jeotrichum

astегоides, выращенного на пит6тель» 5 ной среде в течение 48 ч при аэрации и 28ОС. Препарат имеет активность 14-21 ед/мг белка.

К 800 мг сорбента (октилсилохрома) добавляют 6 мл Ферментного раствора 10 (725 ед.) в 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,2). Условия адсорбции описаны в примере 1. Сорбент с адсорбированным ферментом помещают в колонку (10 мм в диаметре), промывают фос- )5 фатным буфером до.изчезновения белка в промывных водах. Адсорбированный белок элюируют 50%-ным этиленгликолем 15 мл, 0,5%-ным дезоксихолатом натрия 15 мл, как это 20 опйсано в примере 1. Элюирование тритоном х-100 проводят в условиях непрерывного градиента концентрации (О, 01-0,2%, 150 мл) . Получают увеличение удельной активности в 23 раза 25 ,в наиболее активных фракцйях, выход активности 52%.

Пример 4. Очистка липазы на сорбенте с амиловой группой.

Исходным материалом для.очистки служит ферментный препарат, полученный осаждением сульфатом аммония белков из культуральной жидкости микроскопического гриба Jeotrichum аз его1йез, выращенного на питательной среде в течение 48 ч при аэрации и 28ОC. Препарат имеет ак- тивность 14-21 ед/мг белка.

К 100 мг сорбента (амилсилохрома) добавляют 2 мл ферментного раствора (96 ед.) в 0,01 М Фосфатном буфе- . ре .(рН 7,2), Смесь оставляют на

2 ч, периодйчески встряхивая, после чего частицы сорбента с адсорбированной липазой отфильтровывают через бумажный фильтр и проьы- 45 вают буфером до изчеэновения белка в промывных водах. В фильтрате определяют лйполитическую активность и белок. Адсорбированный белок элюируют, как описано в примере 1. 59

Выход фермента 54 % от активности исходного материала. Увеличение удельной активности в 18 раз в наиболее активных фракциях.

Пример 5. Очистка липазы 55 на сорбенте с дециловой группой.

Исходным материалом для очистки служит ферментный препарат, полученный осаждением сульфатом аммония белков из культуральной жндкости микроскопического гриба

Jeotrichum astегоides, выращенного на питательной среде в течение 48 ч при аэрации и 28 С. Препарат имеет активность 14-21 ед/мг белка.

K 100 мг сорбента (децилсилохрома) добавляют 2 мл ферментного раствора (96 ед.) в 0,01 М Фосфатном буфере (рН 7,2). Условия адсорбции и десорбции описаны в примере 3. Выход фермента 61% от.активности исходного материала. Увеличение удельной активности в 14 раз в наиболее активных Фракциях.

Предлагаемый способ обеспечивает получение высококачественного Фермента липазы, по своим качественным характеристикам являющегося эффективным биокатализатором в медицине и пищевой промышленности, предотвращает инактивацию фермента в процессе очистки и обеспечивает высоку активность препарата. Предлагаемый эффект в народном хозяйстве более 100 тыс.руб.

1. Способ очистки микробных липаз методом аффинной хроматографии, включающий сорбцию фермента из раствора на аффинном сорбенте при рН 7-8 и десорбцию фермента органическим растворителем и детергентами, отличающийся тем, что, е целью пов ааения степени очистки липаэ, используют сорбент, представляющий собой силохром с нанесенным полимерным покрытием из сополимера 2,2-ди-(4-эпоксипропилоксифенил)-пройана и поливинилового спирта и присоединенных с помощью гексаметилендиизоцианата С5-С о -алкильных групп.

2. Способ по п.l о т л и ч а юшийся тем, что используют 0,050,2 мг"экв/г сорбента с содержанием

С5-С.(0 -алкильных групп

3. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что десорбцию фермента проводят 50%-ным раствором этиленгликоля, 0,5%-ным раствором дезоксихолата натрия, 0,1-0,6%-ным . раствором тритона х-100 °

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США 9 4013512, кл. С 07 G 7/02, 1977.