Способ получения ферментационного бульона

 

О П И С А Н И Е ÄÄ959634

И ЗЬБРЕТЕ Н ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (6l) Дополнительный к патенту (5l) NL. Кл. (22) Заявлено 04.08.77(21) 2512150/28-13 (23) Приоритет - (32)

05.08. б

03.05.77 (31) 711943, 793274 (33) США

С 12 Р 19/06

Государственный квмитвт

СССР

О Убликовано 15 .09 . 82 . Бюллетень.% 34

Дата опубликования описания 17.09.82

Ilo делам кэовретекий и открытий (53) УДК663.18 (088. 8) Иностранец

Вильям Чарльз Вернау (СИА) (72) Автор изобретения

7Ъ(о j 3, Д ъ т р

Иностранная фирма

"Пфайзер Инк".(CNA) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ фЕРМЕНТАЦИОННОГО

БУЛЬОНА

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения гидрофильного коллоида (ксантовой смолы), являюц егося полисахаридом, который предназначен для вытеснения нефти из частично истощенных скважин.

Известен способ получения ферментационного бульона, используемого для получения растворов для регулирования,, подвижности, применяемых при добыче нефти, предусматривающий культивирование микроорганизмов Xanthomonas campestris â условиях аэрации на питательной среде, содержащей источник углерода, предпочтительно углеводы, источники азота, фосфора, воду и другие необходимые микроэлементы (1).

Недостатком данного способа явля ется то, что для использования целевого продукта его необходимо подвергнуть фильтрации или очистке от нерастворимых вецеств, влияющих на качественные и технические характеристики ферментационного бульона.

Цель изобретения - обеспечение отсутствия в целевом продукте практически нерастворимых веществ, размеры которых превышают 3,0 мкм.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения ферментационного бульоча, используемого для получения растворов для регулироl вания подвижности, применяемых при добыче нефти, предусматривающему культивирование микроорганизмов Xanthomonas campestris в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источник углерода, предпочтительно углеводы, источники азота, фосфора, воду и другие необходимые микроэлементы, в состав питательной среды дополнительно вводят лимонную кислоту, хелат кальция и ионы железа в виде соли сернокислого железа в количествах соответственно равных 0,5-2,0; 0,02-0,07 и 0,0005"0,0025 г/л объема ферментируемой среды.

Кроме того, в процессе культивирования в качестве вещества, способст959634

3 вующего образованию хелатных соединений, вводят этилендиаминтетрауксусную кислоту.

После культивирования в ферментационный бульон вводят Формальдегид в количестве 0,2"10 r/ë.

В качестве источника азота используют нитраты аммония, натрия и калия., Вода для приготовления питательной среды содержит менее чем 20 г/л каль- щ ция и других осаждающих в виде фосфатов катионов.

После культивирования Ферментационный бульон выдерживают в течение

3-4 дней для получения бульона, прак 5 тически свободного от нерастворимых частиц, превышающих размер 0,65 мкм.

Средой для выращивания данного мик" . роорганизма может быть бульон УИ (0tfco) или среда, содержащая неочи- щ щенную глюкозу (церелозу), фосфаты натрия и калия, сульфат магния и любое органическое соединение, являющееся источником -азота, например энзимную выварку соевых бобов или эн- у5 зимную выварку казеина. После аэробного размножения в течение примерно

30 ч при 25ОC аликвоту бульона переносят в ферментер для осуществления второй стадии инокуляции.

Предпочтительными углеводами являются глюкоза, мальтоза, фруктоза, отфильтрованный крахмал или их смеси.

Предпочтительным источником азота является неорганический нитрат: нитрат аммония, нитрат натрия и.нитрат

35 калия в заданных концентрациях.

Магний, как один из необходимых микроэлементов, используют в виде

М9504 7Н О, или горькой соли, добавляя ее в концентрации до 1 г/л, наряду с наличием следов магния и железа. Веществом, способствующим образованию хелатов, является этилендиаминтетрауксусная кислота или, предпочтительно, лимонная кислота, которая используется в качестве реагента, спо" собствующего росту, а также пассиватора для кальция . В качестве буфера для среды, обеспечивающего значение рН 5,95О

8 5, предпочтительно 6,0-7,5, вводят большое количество моно- и дифосфатов калия ..После аэробного размноже-. ния в течение 20-40 ч при 24-34 С, предпочтительно при 28-30 С, аликвоту 55 раствора вносят в бродильный чан, содержащий обеспечивающую получение вещества среду.

Эта среда подобна по составу среде, находящейся во второй стадии инокуляции, за исключением того, что вместо фосфатов калия предпочтительно используют фосфаты натрия (в связи с их низкой стоимостью) и малое количество кальция в форме солей, таких как хлористый кальций или нитрат кальция, или окислов, которые добавляют для увеличения выхода ксантана. Количество добавляемого кальция зависит от количества кальция, присутствующего в воде, исп >льзуемой при приготовлении среды, используемого источника получения азота и видов и цепей используемого микроорганизма Xanthomonas

Если вместе нитрата аммония используют нитрат .натрия или калия, требуется меньшее количество кальция (примерно

27 ч. на млн). Для получения среды можно использовать также деионизован1 йую воду, дистиллированную воду- или воду, содержащую менее 20 ч на млн. кальция и других осаждаемых при образовании фосфатов катионов. Ионы кальция можно добавлять в требуемой концентрации. Роль ионов кальция в обеспечении получения ксантата велика,.но для предложенного способа наиболее существенным является предотвращение избыточного осаждения катионов кальция и других катионов в виде нерастворимых фосфатных солей. Это осуществляют путем добавления реагента, способствующего образованию хелатов, такого как этилендиаминтетрауксусная кислота.

Важным параметром для обеспечения роста бактерий Xanthomonas является рН среды. Предпочтительными значениями являются величины от 6,0 до 7,5.

Регулирование рН в указанных пределах осуществляют использованием буферных соединений, таких как динатрийфосфат, Для предотвращения осаждения ионов е кальция, введенных в воду, в виде. нерастворимых солей кальция в буфер добавляют этилендиаминтетрауксусную кислоту. Предпочтительно регулировать рН в ходе цикла ферментации путем добавления растворов гидратов окиси натрия или калия, при использовании которых обеспечивается дополнительное преимущество, заключающееся в уменьшении вязкости бульона без уменьшения выхода ксантана и в отсутствии необходимости хелатации буферного раство-! ра.

Для быстрой ферментации необходимо точное количество кислорода, обеспе5 959634 6 чивающее рост бактериальной культуры., Растворы для регулирования подвижФерментационную среду аэрируют с це- ности на основе завершенных Ферменталью обеспечения требуемого количест" ционных растворов, полученных в соотва кислорода для получения значения ветствии с предложенным способом, имесульфитного окисления, в пределах от 5 ют фильтрационные отношения которые

I,5 до 3,5 ммоль кислорода на литр пригодны для большинства нефтеносных в минуту. Величина сульфитного окис- месторождений. Если проницаемость ления является мерой скорости кисло- подземных слоев очень низкая то исУ, рода на входе в бродильный чан при пользуют растворы для регулирования перемешивании и осуществлении аэрации i0 подвижности с малыми фильтрационными ферментацию проводят при темпера- отношениями, причем целые или неочитуре около 30 С до тех пор, пока кон- щенные бульоны предпочтительно не должцентрация ксантана в бульоне не ста- ны иметь никаких нерастворимых веществ нет по крайней мере 100 ч. на млн., с размерами частиц, превышающими предпочтительно около t3 и наиболее 15 0,65 мкм. Это можно осуществить прос- -. предпочтительно около 1,43 (30-96 ч). тым хранением готового ферментационно Вязкость раствора составляет обычно ro бульона в присутствии Формальдеги4,000 сП, предпочтительно 7,000 cll. да в течение 3-4 дней. В процессе стаЖелательно убивать микробные клет- рения клетки Xanthomonas сжимаются ки путем добавления бактерицида. Пред-щ таким образом, что их размеры не препочтительным бактерицидом является вышают 0,65 мкм. Клетки имеют форму формальдегид в концентрации 0,2- стержня, причем обычно наибольший раз10,2 г/л, который может быть добавлен мер по длине превышает 0,65 мкм, а на заключительной стадии Ферментации, меньший размер составляет 0,4-1,0 мкм., до или во время хранения. Температура хранения некритична (ОПредложенный способ пригоден для 135ОС, предпочтительно 20-45оС). На работы со многими вариантами бактерий практике хранение при комнатной темпеXanthomonas. Предпочтительным видом ратуре в течение длительного времени является Xanthomonas campestris. осуществляется до тех пор, пока микроI скопическое исследование не показываИспытание на фильтруемость явля- ет, что наименьший размер клеток не ется экспериментальной методикой, при превышает 0,65 мкм (через 3-4 дня), которой измеряется скорость протека- Иетодики испытаний. Готовят 1000 мл ния через фильтр, имеющий микропоры раствора, содержащего 750 ч. -на млн. размером 0 45-3.0 и, как Функция 35 ксантана в растворе соли с концентраот объема при постоянном давлении цией 500 ч. на млн (10:1 NaCI-CaCI) (2,82 кг/см ). Фильтрационное отно- следующим образом. шение соответствует отношению периода В смесителе типа Варинга (Maring), времени, необходимого для собирания снабженном реостатом, замеряют количетвертых 250 мл раствора для регули- 40 чество бульона (основываясь на содер"

-рования подвижности, к времени, ко- . жании ксантана), необходимое для поторое необходимо для собирания первых лучения 0,75 r твердого ксантана.

5 мл этого раствора. Фильтрационное Проводят разбавление от 1 до 6 раствоотношение, равное 1 свидетельствует, ром соли. Сдвигают смесь следующим обо том, что раствор не обладает тенден: разом: 404 мощности (2 мин 60> мощ цией к забиванию. Допустимые значения ности) 2 мин, 803 мощности 2 мин. фильтрационных отношений для раство- Разбавляют раствор в смесителе до ров для регулирования подвижности со- концентрации ксантана 750 ч. на млн. ставляют 1-3 (микропористые фильтры с и сдвигают при 403 мощности B течеразмером пор 0,45-3 мкм), предпочти- ние 2 мин (раствор также используют

50 тельно < 1, 7. для определения вязкости).

Требуемые значения фильтрационных Используют экспериментальное устотношений и размеры пор фильтров, ис- ройство, которое позволяет определять пользуемых для испытаний конкретного скорость протекания через диск из микраствора.для регулирования подвижнос- ропористого фильтра (47 мм размер

S5

У ти, зависят от проницаемости подзем- пор 0,46-8,0 мкм) как функцию от объных слоев нефтяного месторождения, ема при постоянном давлении в 28 н/м . для которого планируется вытеснение Резервуар емкостью 1 л заполняют нефти. 1 л ксантанового раствора (750 ч, .

1,0

4,1

0,69

1,0

7 . 95963 на млн.), создают давление 28 Н/м, открывают клапан и регистрируют объем фильтрата и время (с).

Определяют фильтрационное отношение. S

Определение вязкости. Вязкость определяют с помощью синхроэлектрического вискозиметра Брукфильда (модель

LVT c VL-приставкой). Измерения ведут. при 25 С и скоростях 6 и 12 об/мин. 1о

Вязкость выражают в сантипаузах.

Определение содержания ксантана.

*Ксантан высокой степени очистки содержит около 18,43 глюкуроновой кислоты.

Количество глюкуроновой кислоты в ком 1S позициях на основе ксантана определяют в отсутствие формальдегида и беэ бората при 100 С по методу Кнутсона и Джинса.

Содержание ксантана определяют по формуле

Глюкуроновая кислота, 3 х 100

Пример 1. Клетки Xanthomonas

campestris из косого агара переносят

23

- в 300 мл бульона УИ, находящегося в

2.,8-литровой колбе Фернбаха, и встряхйвают на вращающемся шейкере в течение 31 ч при 28 С. Аликвоту 25 мл .переносят в колбу фернбаха (2,8 л), содержащую 500 мл среды следующего состава, г/л:

Глюкоза-фруктоэа (Изосвит 100) 10,1

Неочищенная глюкоза (церелоза) 25-,1

14Н4 "03 l,0

MgS0 -7H<0 0,10

Мп504-Н о 0,03

Ft.S04- 7Н О 0,01 40

Безводная лимонная кислота

К НР04

КН Р 4

4S

Церелозу и Иэосвит 100 растворяют в дистиллированной воде и обрабатывают в автоклаве по отдельности °

Остальные ингредиенты объединяют, доводят рН до 6,4.и также обрабатывают в автоклаве, Прошедшие раздельную об-работку в автоклаве материалы затем объединяют вместе.

После встряхивания при 28 С в течение 33 ч 200 мл раствора перемещают в 4-литровый ородильный бак с механической мешалкой, содержащей 2 л среды следующего состава, г/л:

4 8

Церелоза 25 7 автоклавируют ю отдельности) .

Изосвит 100 10,1 1Н4 1103 1,0

MgS04 7Н О 0,10

MnS04- Н 0 0,03

FeS04. 7Н О 0,10

Безводная лимонная кислота 1,0

CaC 1 -2Н О O 20

NaHP04 3 3"

NaH P04 0 70

Сахара растворяют в 300 мл воды, обрабатывают в автоклаве по отдельности, остальные ингредиенты растворяют в 1700 мл воды, обрабатывают в автоклаве, после чего объединяют оба раствора. Затем проводят аэрацию с такой скоростью, чтобы обеспечить количество кислорода 1,5-3,5 ммоль/л в минуту. ферментацию проводят при 30 С в о течение 48 ч, при этом рН раствора поддерживают на уровне 5-7,5 добавлением буфера на основе фосфата натрия, разведенного в водопроводной воде.

8 буфер на основе фосфата натрия добавляют также этилендиаминтетрауксусную кислоту для предотвращения осаждения фосфата кальция. В конце ферментации вязкость бульона 7800 сП (при скорости сдвига 6,27 сек "), выход ксантана 1,53.

Раствор для регулирования подвижности имеет фильтрационнде отношение

1,7 (микропористый фильтр с размером пор 3 мкм).

Пример 2. Повторяют методику примера 1 с использованием следующей ферментационной среды, г/л:

)Посевная среда 1-я стадия (Церелоза 10,0 (W4) VV04

КНЕ04 1,0 мяьо4 7н40 0 5

N7-амин УТ (энзим-. ная выварка казеина ) рН -7,0 11,0

>Посевная среда (2-я стадия)(0- глюкоза (обрабатывают в автоклаве по отдельности) 27,0

0-фруктоза 3,0

+14<03 110 м9504 7н 0 . 0,10

»S04- Н 20 0,03 еь04. 7Hi0 Oi01

Безводная лимонная кислота

9596

44,2

4,53 I 4,2

3 17

Формула изобретения

К НРО„

КН,РО4 0,69

>Среда,для получения продукта <

0-глюкоза (обрабатываются в автоклаве 5 по отдельности) 27,0

0"фруктоза 3.,0

Безводная лимонная кислота l,0 нн4ио, 1,О

Ng SO4. 7Hg0 О 1О

HnSO4 HZ0 0,03

FeSO4 ° 7H 0 0,01

СаС1 . 2Н О 0,20

NaqHP04 3,34 йаН Р04 О 70

Ферментацию осуществляют так же, как и в примере 1, за исключением того, что регулирование рН осуществляют раствордм гидрата окиси натрия 3ф без одновременного добавления этилендиаминтетрауксусной кислоты.

Il p и м е р 3. Ферментацию в крупном масштабе осуществляют следующим образом. 2$

Среда для посевного материала (1-я стадия), г/л:

Церелоза 10,0 (ЙН4) РНО, 2,0

КН Р04 1,О

Hgso+- н о о,5

NZ-амин УТ рН -7, О 11, О

Среду вводят порциями по 500 мл, в две 2,8-литровые колбы Фернбаха.

После обработки в автоклаве и охлаждения колбы засевают клетками культуры

Xanthomonas campestris. После встряхивания в течение fU ч при -28ОС содержимое обеих колб объединяют и использует для засевания бродильного чана емкостью 200 галлонов (757,08 л).

Посевная среда (2-я стадия ), г/л:.

Церелоза 10,0 (МН4) НР04 2,0

КН Р04 0 453

Горькие соли 0,226 й7.-амин Ут рн - 7,0 4,99

Ферментационную среду перемешивают механической мешалкой, аэрируют до получения 1,5-3,5 ммоль кислорода на литр в минуту. Через определеные проSO межутки времени добавляют раствор гидрата окиси натрия для поддержания рН на уровне 6,0-7,5.

Для регулирования образования избыточной пены добавляют соевое масло..

После проведения ферментации s течение 48 ч объем смеси. достаточный.для того, чтобы получить 53 соотношение

34

lÎ объемов, переносят в бродильный бак емкостью 2000 галлонов (7570 л), содержащий 800 галлонов (3028 л) среды следующего состава:

>Посевная среда (3-я стадия)(ЙН4МО (503-ный раствор), л 42,8

К НР04,, кг 12 5

КН<РО4, кг 2,15

Горькие соли, г 306

MgS04 Н О r 94

FeS04-7Н 0, r 30,5

Церелоза, кг 79, l (обрабатывают по отдельности в автоклаве)

Изосвит 100, кг 31,75

Безводная лимонная кислота рН 7,0,кг 3,05

После ферментации прй вышеупомянутых условиях в течение примерно 31 ч объем, достаточный для получения 103 соотношений объемов, переносят в бродильный бак емкостью 2000 галлонов (7570 л), содержащий 1200 галлонов (4163 л) следующей среды:

Церелоза, кг 135,4 (обрабатываются в автоклаве по отдельности )

Изосвит 100, л

4 3 раствор), л 7,57

Гидратированный из вестняк, кг . 0,33

Безводная лимонная кислота, кг

Na

NaH

Горькие соли (И9304.7H

MgS04 О О, г 141

FeSO4.7Н О рН "7,0 г 45,4

Таким образом,.ферментационный бульон, полученный по известному способу, обеспечивает получение растворов для контроля подвижности с концентрацией 100-300 ч. на млн. коллоида ксантомонаса и не содержит нераство" римые вещества, имеющее размеры частиц, превышающие 3 мкм.

l, Способ, получения ферментационного бульона, используемого для получения растворов для регулирования подвижности, применяемых при до11 =9596 быче нефти, предусматривающий культивирование микроорганизмов Xanthomo" паз. campestrts в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источник углерода, предпочтительно углеводы, источники азота, фосфора, воду и другие необходимые микроэлементы, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью обеспечения отсутствия в целевом продукте практически нерастворимых ве-10 ществ, размеры которых превышают

3,0 мкм, в состав питательной среды

"дополнительно вводят лимонную кислоту, хелат кальция и ионы железа в виде соли сернокислого железа в количест-, 15 вах соответственно равных 0,5-2;0;

D,02»0,07; 0,0005»0,0025 г/л объема ферментируемой среды.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в процессе куль- 2о тивирования в качестве вещества, способствующего образованию хелатных со. единений, вводят этилендиамидтетрауксусную кислоту.

3. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и Й с я тем, что после культивиро34 12 вания в ферментационный бульон вводят формальдегид в количестве 0,2-10 г/л.

4. Способ по и, 1, о т л и ч аю шийся тем, что в качестве источника азота используют нитраты аммония, натрия и калия.

5. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что вода для приготовления питательной среды содержит менее чем 20 г/л кальция. и других осаждающих в виде .фосфатов катионов.

6. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что после культивиро.вания ферментационный бульон выдерживают в течение 3-4 дней для получения бульона, практически свободного от нерастворимых частиц, превышающих размер 0,65 мкм.

Приоритет по пунктам:

05.08.76 по пп. 2-5, 03.05.77 по пп. 1, 6.

Источники информации,-. принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Cll)A N 3427226, кл. 195-31, опублик. 1969.

Составитель И. Привалова

Редактор Л. Веселовская Техред С.Мигунова Корректор Г. Р-Заказ 7039/79 Тираж 505, Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва Ж;35 Раушская наб. а, 4/5

» 3»=А» «»А«»»2»»

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,