Способ получения гетерополисахарида

 

Изобретение относится (технологии и касается способа получения ксантанового гетерополисахарида, который может быть использован в качестве эффективного агента в пищевых продуктах, косметике и т.д. Целью изобретения является повышение выхода и улучшение физико-химических свойств полисахарида. Способ заключается в выращивании нового штамма Xanthomenas campestris NCIB 11854, который обладает высокой скоростью роста и биосинтетической активностью и способен накапливать порядка 14 г/л полисахарида. 6 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

0% (И) А3

®CEC@H)appal 1

1 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К IlATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3753904/28-13 (22) 28.06.84 (31) 8317696 (32) 29.06.83 (33) GB (46) 15.04,88. Бюл. № 14 (71) Шелл Интернэшнл Рисерч Маатсхаппий В.В. (NL) (72) Джон Дэвид Даунз (GB) (53) 663, 15(088.8) (56) Патент США № 3485719, кл. 195-31, 1969 ° (54) СНОСОВ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОПОЛИСА (АРИЦА (51)4 С 12 Р 19/06, С 12 N 1/20//

//(С 12 N 1/20, С 12 R 1:64) (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения ксантанового гетерополисахарида, который может быть использован в качестве эффективного агента в пищевых продуктах, косметике и т,ц. Целью изобретения является повышение выхода и улучшение физико-химических свойств полисахарида. Способ заключается в выращивании нового штамма

Xanthomenas campestris NCIB 11854, который обладает высокой скоростью роста и биосинтетической активностью и способен накапливать порядка 14 г/л полисахарида. 6 табл.

1 i389bH:3 2

Изобр тение относится к биотехнологии и касается способа получения ксантанового гетерополисахарида, который может быть использован в качестве эффективного агента в операциях по вторичной регенерации масел, за" густителей в пищевых продуктах, косметике и т.д. и также в качестве агентов, способных образовывать съедобную пленку, и в качестве эмульгирующего агента, например, в чернилах для печатания, а также в качестве загустителя в пастах для печатания в текстильной промышленности, 15

Целью изобретения является увеличение выхода и улучшение физико-химических свойств полисахарида.

Новый штамм; Xanthomonas campestris депонирован в Национальной Коллекции 0

Промьлпленных Бактерий, Торри Рисеч

Стейшн, Абердин под номером !1854, Ытамм 11СХВ 11854 демонстрирует более высокую скорость роста в синтетической солевой среде, значительно более высокую специфическую скорость производства полимера и его можно выращивать как в непрерывных условиях, так и периодических.

Национальная Коллекция Промышлен-. 30 ных. бактерий располагает также штаммом ИСХВ 11803 который обладает ,сходными признаками со штаммом МСХВ ! 1854,, Морфолого-культуральные и физио35 лого-биохимические признаки штамма.

Морфолого-культуральные признаки, A. Окислительный питательный бульон

СМ1 + 0,751 arapa Дифко инокулировали молодыми выросшими микроорганизмами 4 и ипкубировали в течение 7,5 ч при

25 С. Клетки с пятен размером выросшей культуры 0,2 мм исследовали и фо. тографировали на месте (in situ) при фазовом контрасте со скользящей диаф45 рагмой. Подвижность и другие характеристики определили в пулах, окружающих О, 1 р м стеклянные шарики, расположенные на других пятнах. Клетки на краях выросшей культуры встречались по одной и парами, при этом размер

50 клеток составляет: ширина 0,4-0,5р и и длина 1,2-2,5 р м для NCIB 11803 ширина 0,5-0,6 1м и длина 1,2-2,5 1.м для NCIB 11854. На полях выросших культур в пулах видны агрегаты, сос55 тоящие по количеству от сотен до нескольких тысяч клеток с NCIB 11803, но намного реже с ЯСТВ 11854. МобильПитательный бульон

Р 2 (Оксоид)

Желатина (Дифко)

Желатиновые чашки.X:

11итательный агаровый оксоид СМЗ

Желатина

Молочные чашки, /:

Снятое молоко (Дифко), отдельно стерилизованное

Пептон (Дифко)

Экстракт ветчины

LabLemco О,1

NaCI 0,5

Агар 1,5 рН 7,4 до автоклавирования

2,5 i 2,0

2,8

i,0

3,0

0,1 ность положительная. При использовании условий, как в А, но с добавлением 0,5Х глюкозы в среду и инкубированием в течение 7 ч, получили аналогичные результаты, за исключением того, что клетки были на О, 1 р м шире и не были видны агрегаты с NCIB 11854.

Б. После выращивания в течение

48 ч при 30 С в чашках с окислительным питательным агаром СМЗ наблюдали хороший рост, выделенные колонии желтого цвета, круглые, целые, слизистые, гладкие, волокнистые и выпуклые. Диаметр колоний для 11803

1-1,5 мм для NCIB 11854 1,5 мм.

В. Спустя 72 ч после начала выращивания при 30 С »а среде, аналогичной в А, но с добавлением 17 глюкозы, рост был хорошим, выделенные колонии бледно-кремового цвета, круглые, целые, очень слизистые, гладкие и выпуклые, в то время как выросшие слившиеся колонии желто-кремового цвета.

Диаметр колоний для NCIB 11803 2 мм и для 11854 2,2,5 мм.

Селективная морфология. Минеральное основание Паллерони 6 Доудорофф

1972 модифицированное (PD), г:

NagНР0 12H) О 6,0

КНРО 2,4

NH,С1. 1,0

М8804 7Н О 0,5

FeCI з. 6Н О 0,01

СаС1 . 6Н О 0,01

Деионизированная вода До1л рН 6,8

PD минеральное основание + 0,1X фильтро- стерилизованная глюкоза (РРЬ), желатиновый столбик, /:

1389683

Биохимические характеристики: при

30 С за исключением особо оговоренных случаев, рост при 0 С на СМ3 чашках:

Температура, С 5 3 37

Рост (не количественный) + +

Интервал роста рН íà CMl буль10 оне (выверенный рН) рН 35728910

Рост 3+ 3+ 3+ 3+ 3+

Рост в присутствии соли. Основная среда, содержащая NaC1 в концентрации

2,3,4 и 5%, приготовлена в соответствии со способом по Хейварду и Ходжкису. Культуры инкубировали в течение

3 дней.

NCIB 11854 менее терпим к соли, чем NCIB 11803.

NaCl, 7 2 3 4 5

NCIB 11803 рост 3+ 3+ 3+

NCIB 11854 рост 3+ 3+ +

Гидролиз желатины и казеина.

Культуры инкубировали в течение

7 дней. Желатиновые столбики содержались при 20 С. NCIB 11854 показал меньшую степень протеолитической активности, чем NCIB 11803 (см. табл.1).

Тесты на требования факторов роста, Субкультуры подготовили в виде прямой проволоки трижды в среде PDG c дистиллированной водой на стекле.

Получили удовлетворительный рост через 4 дня, при этом особых требований к факторам роста не было.

Тест на стимулирование метионимом.

Одну каплю слегка мутной молодой выросшей культуры в среде PDG с дистиллированной водой на стекле инокулировали в PDG с и без 10 / г/мл L-метионином в 1 мл в 16 мм трубках. Факта стимуляции скорости роста L-метиони45 ном не наблюдали.

Использование источника углерода.

Среду PD с одними источниками углерода (О, 1X), стерилизованными с фильтром (табл. 2), инокулировали и инкубировали в течение 14 дней. Обна- 50 ружили слабые расхождения в скоростях роста между штаммами.

Получение кислоты из углеводов.

К окислительно-ферментационной среде Хейварда и Ходжкиса добавили 1Х 5 стерилизованных с .фильтром источни- ков углерода, приведенных в табл. 2

L (знак + — вместо DL) . Трубки инокулировали и инкубировали в течение

14 дней. Кислоту получали Н3 галакто.,зы и мелибиозы с помощью NCIB 11854, но не NCIB 11803.

Грамотрицательные неферментативные вещества даны в табл. 3.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что штамм 11854 демонстрирует лучшую кинетику производства полимера в определенной среде, лучший: рост с неорганическим азотом (в особенности NH +) и стабильность в неФ прерывной культуре в синтетической солевой среде.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример. Xanthomonas campestris

NCIB 11854 выращивают.на трех различных химических синтетических солевых средах (табл. 4) в сосуде емкостью 7 л, в циклических условиях.

В первом эксперименте единственным источником азота для роста микроорганизмов служит ион аммония (24 мИ), позволяющий достичь экспонентного роста клеток до максимальной концентрации 3 г/л.

Во втором и третьем экспериментах аммоний заменяют нитратом (24 мМ) и глютаматом (24 мМ) соответственно.

Результаты приведены на фиг. 1-3.

Как видно из сравнения схем по фиг. 1-3, глютамат как источник азота является наиболее предпочтительным, поскольку он дает р макс, т.е. максимальную скорость роста клеток

О, 12 ч ", qn величину, т.е. специфическую скорость производства полимера в 0,36 г (г ") ч и конечный выход полимера В 0,59 гл . Эта комбинация высокой макс и высокой qn дает продуктивность полимера в .итоге 0,49 r (1 ) ч, что вдвое больше обычной продуктивности гетерополисахаридной ферментации с использованием Xanthomonas campestris МИБ.В-1459.

На табл. 5 (А) приводится р макс, qn, гг, т.е. специфическая скорость расхода глюкозы, В д — выход полимера на глюкозе и П вЂ” полимерный продукт для Xanthomonas campestris NCIB

11854, в определенной выше ростовой среде с солями и (В) — соответствующие величины для Xanthomonas campestris NRRL В-1459.

Условия роста для культуры Xanthomanas campestris NCIB 11854 следующие:

Температура, С рН

Импеллер

1389683

28

6,8

Турбина Раштона с лопастями 3 4

1,0

20,0х10 з

10, Ох10

10х10

l0x10

До!л

Таблица

Штамм

NCIB 11803 +

NCIB 11854

+ слабый 1

Скорость импеллера, об/мин 1000

Объем культуры, л 4,5-5,0 рН контроль 1N Na0H+1N КОН

Давление растворенного О 80 мм Hg

Скорость потока воздуха, л/мин 1,0

Как видно из табл. 5, улучшилось действие Xanthomonas campestris NCIB

11854 в сравнении с Xanthomonas

campestris NRRL В-1459.

В табл. 6 даны сравнительные данные фильтрационной способности Xantho-20

monas campestris 11854 бульона с фильтрационной способностью Xanthomonas campestris ЯКИ В-1459 бульона при раэбавлении до постоянной вязкости в растворах различной солевой 25 концентрации. Фильтруемость растворов . с вязкостью 20 сИэ (вязкость измерена при коэффициенте сдвига 7,5 с " ).

Для фильтрации используют фильтры

"Миллипор" (торговая марка), имеющие диаметр 47 мм 5 ри 1,2 р — размеры пор. Как видно из табл. 6, фильтруемость бульона с Xanthomonas campestris NCIB 11854 до и после знзимати" ческой обработки значительно лучше, 35 чем у известного.

Формула изобретения

Способ получения гетерополисахари-40

1 да, предусматривающий выращивание микроорганизма-продуцента вида Xanthomonas campestris на питательной среде, содержащей в качестве источника углеРода глюкозу, источники азота, фосфо- 45 ра, минеральные соли и воду, в условиях аэрации и перемешивания до максимального накопления целевого продукта и последующее его выделение, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода и улучшения физико-химических свойств гетерополисахарида, в качестве микроорганизма-продуцента используют штамм Xanthomonas campestris NCIB 11854, при этом в питательную среду в качестве источника азота вводят глютамат натрия, минеральных солей — хлористый кальций двуводный, серно-кислые магний, железо (II), марганец, цинк семиводные, серно-кислую медь пятиводную, хлористый кобальт шестиводный, молибденовокислый натрий двуводный, йодистый калий и борную кислоту при следующем соотношении входящих в нее ингредиентов, г/л воды:

Глюкоза 23,4

Глютамат натрия 24,0

Фосфорно-кислый калий однозамещенный 25,0

Фосфорно-кислый натрий двузамещенный 25,0

Хлористый кальций двуводный

Серно-кислый магний семиводный 2,0

Серно-кислое железо (II) семиводное 0,2

Серно-кислый марганец семиводный 20,0х10

-3

Серно-кислый цинк семиводный

Серно-кислая медь

3 пя тиводная 20,0х10

Хлористый кобальт з шестиводный !0,0х10

Молибденовокислый натрий двуводный

Йодистый калий

Борная кислота

Вода

Желати- Желати- Молочная новый новая чашка столбик чашка

1389683

Таблица2

Рост на одном источнике углерода

Углерод и произ- Производство кисловодные сахара ты иэ О- F среды

NCIB NCIB

11803 11854

NCID NCIB

11803 11854

Рибоза

Ксилоэа

Следы

-Слабый Слабый

Арабиноза

Слабое Слабое

Рамноза

Глюкоза

Фруктоза

Сахароза

Трегалоэа

Целлобиоза

Слабое +

2-Кетоглюконат

Сахарат

Жирные кислоты

Ацетат

Слабый Слабый

Пропионат

Бутират

Дикарбоновые кислоты

Иалонат

Слабый +

Оксикислоты

D(-)-тартрат

Мезо — тартрат

DL-3-гидроксибутират

DL-лактат

Глюколлат

Другие органические кислоты

Левупинат

Цитраконат

1389683

Продолжение табл. 2

Углерод и и водные саха ои исерода

854

Мезаконат

Сахарные спирты и гликоли

Эритрит

1 Сорбит

Мезо-инозит

Адонит

Пропиленгликоль

2,3-Бутиленгликоль

В-Маннит

Спабое +

Слабый

Глицерин

Спирты

Метанол

Слабый

Этанол

Гераниол

Беэазотные ароматические и другие циклические соединения

Мета-гидроксибензоат

Пара-гидроксибензоат

Тестостерон

Алифатические аминокислоты

L-Валин

L-Аргинин +

Аминокислоты, имеющие кольцевую структуру

Гистидин

L-Триптофан*

Антраннлат*

Амины

Бензиламин*

Углерод и пр водные сахар

Триптаминамиламин

Различные соединения

Бетаин

Манноза* Добавочное соединение.

Таблица3

Показатели

11803 11854 11803 11854 11803 11854

Температура инкубации, С 30

30

30

Рост при, С

Глюкоза

Коричневый дийфундируюнЖй

0NPG 5 С +

Пигмент в культуральном бульоне

Apr. М11ег -ЗС +

Ъетаин CSU — 37 С

Лиз. М11ег

Глюкоза CSU

Орн. М11ег

И01 до 000 — Рост при рН 3-5 3+

Лактат CSU

Пантотенат

Углеводы и производные сахара (продолжение)

Галактоза*

Лактоза*

Мальтоза*

Мелибиоза*

Пи о циа ни н

Флуоресценция

L-Apr С SU

1389683 12

Продолжение табл. 2

Вьщеленный NCIB

) Т

1389683

14 абл. 3

Продо

7,2 3+

-8 3+

+9 3+

3+

Ацетат CSU

ДНК-аза

20 С +7

Жел. столб.

Рост в

NaC1

Жел. чаш" ка +

Стрептомицин

+ 2% 3+ 3+

37 3+ 3+

Слаб. 47. 3+ 3+

Хлорафен

Казеин +

Тетрациклин

+ 57—

+++ Крахмал +

+++

Новобиоцин

Лецитин—

Полимиксин В

О/129

Леван

В трипроновом бульоне

Индол

Требования к факторам роста

Н g(TSI) (Глюко- (Глйко- + Ацетатная слаб. слаб. за CSU) за" CSU) + бумага +

Твин 80

Уреаза

Пепто- Пенто- VP. Молоко низи- низирова- ровано но

Выделе- Выделе- Арг но но Торили

Чувствительность

Пенициллин С

00 до N<

Остат НОЯ

Яичный

Липаза

Яйца

Коричневый диффундирующий пигмент

Таблица4

Концентрация, мМ, среды (2 ) 3

Компонент

23,4 (г!л) 24,3 (г/л) 24,5 (г/л) Глюкоза

12 (24 мМ N) 24

25

25

25

СаС1 - 2Н О

0,2

0,2

0,2

H pO3

Иа ИоО 2Н 0

10х10

Таблица5

qn, r(r ) гг r/r ") Вг, г(г ) П, r(I ) Источник азота

Опыт р макс (ч ) -t ч ч ч -1

0,39

0,60

0 53

0,275

0,09

Аммиак

0,38

0,52

0,60

0,084

0 35

Нитрат

А 2

0,12

0,49

0,59

0,68

0,36

Глньтамат

Аммиак

О, 13

0,51

0,08

0,03

В

0,11

0,21

0,41

0,07

Глют амат

*HO — не определено. (ИН,),80+

NaNO

Na глютамат

КН РО

Na HPO, ®SO, 7Н,О

FeSOg 7Н О

МпБО 7Н O

ZnSO< 7Н<О

Cu SO. . 5Н О

СоС1 6Н О

20z 10-3

20х10-3

20х10

10х10

10-3

10х10

20х10

20х10

20х 1О

10х10

10х10

10х10

10х10

20х10 3

20х10

20х10

10х10

10х10 З

10х10

1Ох10

l 389683

Та блица 6

Образец

Штамм

5p + ПФ"

А. В 12 NaCl + 0,1X СаС1 при 30 С и избыточном давлении 1 атм

NCIB Бульон 11,0 63,0

0,71

11854 Обработанный 9,5 29,3 ферментом

ИИИ Бульон 17,5 59,6

0,73

0 74

В-1459 Обработанный ферментом 19,0 188,0

0,74

В. В 1Х NaCl + 0,1Х СаС1 при 70 С и избыточном давлении 1 атм

NCEB Бульон 37,3

7,5

0,71

11954 Обработанный 17,0 ферментом

ЯКИ Бульон 35,8 50,7

5,5

0,73

0,74

В-1459 Обработанный 8,5 40,9 ферментом

0,77

С. В 15Х NaC1 + 1,5Х CaC1 q при 30 С и избыточном давлении 1 атм

14,5

0,58

330

Бульон

NCIB

0,56

101

11854

22,1

0,61

30,8

81,7

NRRL

1000

0,63

1000

В-1459

В 15Х NaCl + 1,5Х СаС1 при 70 С и избыточном давлении 1 атм

0,58

299

17,0

Бульон

NCIB

1000

0,56

11854

1000

1000

1000

0,61

NRRL

0,63

1000

В-1459

1000

5,8,6

17,5

188, О

19,0

В-1459

В. В

37,3

7,5

Бульон

NCIB

Обработанный ферментом

Бульон

Обработанный ферментом

Обработанный ферментом

Бульон

Обработанный ферментом

Бульон

Обработанный энзимом

1Х NaC1 + 0,1Х

Время фильтрования для 200 мл, с Сухой вес

l полим. /л

1, 2р**

СаС1 при 70 С под давлением 1 атм

20! 389683!

Продохпкенне табл.6

1 азец

ПФ*

11854

17,0

5,5

50,7

35,8

NRRL

40,9

8,5

В-1459 Обработанный энзимом

С. В 15X NaCl + 1,5Х СаС1 при 30 С под давлением 1 атм

NCIB

330

14,5

Бульон

101

22,1

11854

81,7

30,8

NRRL

В-1459

i1000

>1000

СаС1 при 70 С и давлении 1 атм

D. В

299

17i0

Бульон

NCIB

>1000

>1000

11854

NRRL

Бульон

В-1459

*Пф — префильтр для сепарации грубого материала

** Без предварительного фильтра, но раствор ранее пропускали через

5p + префильтр.

Обработанный энзимом

Бульон

Обработанный энзимом

Бульон

Обработанный энзимом

15X NaCl + 1,5Х

Обработанный энзимом

Обработанный энзимом

>1000

)1000

)1000

)1000

Сухой вес полим./л

1389683 в

0 а

1 38 9683

ФР 5Ð фема (r) Рие 3

Редактор M.Недолуженко

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, Составитель 3:Фалунина

Техред М.Коданич Корректор А.Обручар

Заказ 1587/58 Тираж 520 Подписное

ВШФП1И Государственного комитета СССР но делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Ь гп

1

15 <> ь

m b

М 1

Ь

1 э