Способ дезинтеграции микроорганизмов для получения коклюшного антигена

 

Е. П. Москаленко, В. N. Лубэ, Н. и Л. Н. Чернавская изобретения!

i

Ростовский государственный медицинскй1HHCTHT JT (71) Заявитель (5 4) СПОСОБ ДЕЗИНТЕГРАБИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КОКЛЮШНОГО АНТИГЕНА

Изобретение относится к медицине и касается способа дезинтеграции микроорганизмов для получения антигенов.

Известен способ дезинтеграции микроорганизмов для получения хоклюшного

5 антигена путем обработки суспензии микроорганизмов ультразвуком в статическом режиме с последующим отделением надосадочной жидкости 1 1.

Однако известный способ не обеспечи- в вает высокой серологической активности антигена.

Белью изобретения является повышение серологичесхой активности антигена.

Эта цель достигается тем, что согласно способу дезинтеграции микроорганизмов для получения коклюшного антигена путем обработки суспензии микроорганизмов ультразвуком с последующим отделением надосадочной жидкости, обработку рв ультразвуком проводят при непрерывном движении суспензии в замкнутой системе при частоте 42-50 кГц и амплитуде

60-80 мкм в течение 13-18 мин., Способ осуществляют следующим образом.

Для получения антигена используют коклюшные микробы штамма 222, которые выращивают на казеиново-угольном агаре (среде КУА) при + 36 С 72 ч.

Выращенные микроорганизмы собирают с питательной среды стеклянным шпате» лем и суспендируют в стерильном физио логическом растворе рН 7,0-7,2, дово дят концентрацию микробной взвеси до

15.10"" микробных тел в 1,0 мл. Дез интеграцию коклюшных михробов в данной концентрации проводят 13-18 мин в циркулирующей системе с частотой ультра звуковых колебаний 44 кГц, амплитудой

70 мкм. B результате ультразвуковой обработки взвеси происходит разрушение клеток микроорганизмов н выделение в раствор антигенных комплексов. Получен» ноя центрифугированием при 18,000об7мин в течение 60 мин при+ 5оС надосадочная жидкость представляет антигенный кома

3 МИ020 лекс, является цельньгм продуктом и собирае тся в стерильный сосуд. Для более полного выделения коклюшного антигенного комплекса микробные остатки вновь ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе, помещают в хамеру для ультразвуковой обработки и вновь двух - трехкратно повторяют цезинтегра» ции 4-6 мин, каждый раз отделяя антигенный комплекс центрифугированием 10 . при 18,000 об./мин в течение 60 мин при+ 5 С.

На чертеже изображена установка

gna реализации предлагаемого способа, общий вид. 15

Установка содержит ультразвуковой генератор 1, акустический концентратор

2, камеру 3 для обработки микробной взвеси, систему 4 трубопровода, кран 5 для слива дезинтегратора, пульсонасос 6, центрифугу 7 (IlJIP-1).

Установка работает следующим образом.

Приготовленную бактериальную взвесь

25 заливают в камеру 3, акустический концентратор 2 помещают в верхнюю часть камеры 3, включают генератор 1, обеспечивающий получение ультразвуковых коле баний частотой 44 кГц, амплитудой 70 мкм, 30 и одновременно включается в сеть пульсонасос 6. Взвесь под действием пульсонасоса 6 циркулирует по системе 4 трубопровода, попадая в камеру З„подвергаг ется ультразвуковой дезинтеграции. После обработки 13-18 мин пульсонасос 6 и генератор 1 отключают, дезинтеграт сливают через кран 5, помешают в центрифугу 7 и центрифугируют при 18,000 об/мин

60 мин при +5 С. Надосадочную жидкость представляющую собой выделенный анти-, 40 генный комплекс, сливают, а микробные остатки вновь ресуспендируют в первоначальном объеме физиологического раствора, помешают в камеру 3 и повторяют цикл дезинтеграции 2 - 3 раза в течение 45

4 — 6 мин, каждый раз отделяя антигенный комплекс центрифугированием.

Пример . Культуру 80г С е а

per <.ussis штамм 222, выращивают на казеиново-угольном агаре (среда КУА) при + 36 С 72, ч. Выращенные микроорганизмы собирают с питательной среды стеклянным шпателем и суспендирук т в стерильном физиологическом растворе рН 7,0 - 7,2, доводят хонцентрацию ми- 5 кробной взвеси до 15 10"" микробных тел в 1,0 мл по оптическому стандарту мутности Государс гвенного контрольного института медицинских и биологичесхих нрепаратов им. Л. А. Тарасевича. 50 мл приготовленной михробной взвеси заливают в камеру 3, акустический концентратор

2 помешают в верхнюю часть камеры 3, включают генератор 1, обеспечивающий получение ультразвуковых колебаний частотой 44 кГц, амплитудой 70 мкм и одновременно включают в сеть пульсонасос 6.

Взвесь под действием пульсонасоса 6 циркулирует по системе 4 трубопровода, и, попав в камеру 3, подвергается ультразвуковой дезинтеграции. После дезинтеграции 15 мин пульсонасос 6 и генератор 1 отключают, дезинтегратор сливают через кран 5, помешают в центрифугу 7 и центрифугируют при 18,000 об./мин о

60 мин при + 5 С. Надосадочную жидкость, представляющую собой выделенный антигенный комплекс, сливают, а михробные остатки вновь ресуспендируют в первоначальном объеме физиологического раствора, помешают в хамеру 3 и повторяют цикл дезинтеграции 2 раза в течение 5 мин, каждый раз отделяя центрифугированием антигенный комплекс.

Контрольную (неозвученную) и опытные (после воздействия ультразвука) микробные взвеси исследуют в реакции агглюти- . нации с коклюшными агглютинирующими сыворотками, полученными из Института эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н. Ф. Гамалеи, определяют количество разрушенных коклюшных бактерий методом сравнения со стандартом мутности.

Выделенные при центрифугировании антигены исследуют в различных серологических реакциях. Специфическая активность коклюшных антигенных комплексов изучается в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) параллельно с реакцией торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА), в реакции двойной диффузии в геле по Оухтерлони и в иммуноэлектро форезе по П. Грабару в модификации

B. С. Uaerxoaa, количества белка в них определяется по методу Лоури и на спекч рофотометре «Spectromem202" при длине волны 280 Нм.

Сравнительные данные серологичесхой активности антигенов приведены в таблице.

Извет- 50,0 ный

Предлагаемый 50

321+014

2,33 + 0,08

2,17 Ф 0,19

371 3028

3,16 + 0,09

2,75 + 0,13

Исследования оптической плотности контрольных и опытных суспензий коклюшных микробов показывают, что под действием ультразвуковых волн происходит дезинтеграция микроорганизмов, степень 2$ которой возрастает с увеличением Кра ности воздействия ультразвука.

Исследования по выделению количества гемагглютинирующих единиц активности (ГЕ) из 1 млрд. микробных клеток, пока-зо зывают, что известный способ позволяет выделить 27 ГЕ антигенной активности, тогда как способ по изобретению 94 ГЕ.

Использование изобретения позволяет повысить серологическую активность антигена и его выход.

Формула изобретения

Способ дезинтеграции микроорганизмов для получения коклюшного антигена путем обработки суспензии микроорганизмов ультразвуком с последующим отделением надосадочной жидкости, о т л и ч а юm и и с я тем, что, с целью повышения серологической активности антигена, об»

Работку ультразвуком проводят при йепре» рывном движении суспенэии в замкнутой системе при частоте 42-50 кГц при амп литуде 60-80 мкм в течение 13-18 мин.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

М 571271, кл. А 61 К 39/00. 1975.

975026

Составитель Г. Смирнова

Редактор Н. Бобкова Техред М.Коштура Корректор О. Билак

Заказ 10392 Тираж 714 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., и. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4