Способ получения иммунной сыворотки для выявления патогенных стафилококков в молочных продуктах

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 29.12,78 (21) 2701664/28-13 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет—

Опубликовано 23,0982. бюллетень ¹ 35

Союз Советских

Социалистических

Республик

«»959787

f ъ -: % ,и

Р 1м. Кл.

A 61 К 39/395

Государственный коми ет

СССР по делам изобретений и открытий

{533УДК 615.373. . 3 (088.8) Дата опубликования описания 23. 09. 82 (72) Авторы изобретения

T.A.Флегонтова, С.A.Анатолий и Ю.Н.Зубжицкий н (=

Ленинградское отделение Всесоюзного научноИсследовательского института молочной утромышленности и Научно-исследовательский институт кспериментаЛЬной медицины ANH СССР (71) Заявители

{54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУННОЯ СЫВОРОТКИ

ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ СТАФИЛОКОККОВ

В МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ

1 2

Изобретение относится к микробиологии и касается методов .диагностики для быстрого и достоверного выявления патогенных стафилококкоь при наличии их в пищевых продуктах.

Известен способ получения иммунной сыворотки для выявления пато. генных стафилококков в молочных про-дуктах, включающий отбор штамма стафилококка, обладающего признаками патогенности, с последующей иммунизацией отобранным штамком кроликов, забором крови и отделением сыворотки (1).

Однако известный способ является сложным и трудоемким, так как требует

13 типовых иммуносывороток.

Целью изобретения является упрощение способа. Цель достигается тем, что согласно способу получения иммунной сыворотки для выявленйя патогенных стафилококков в мОлочных продуктах, включающему отбор штамма стафилококка, обладающего признаками патогенности, с последующей иммунизацией от6бранным штаммом кроликов, забором крови и отделением сыворотки, иммунизацию проводят штаммом стафило кокка, обладающим одновременно признаками патогенности, вирулентности и антигенной общности со всеми штаммами стафилококков международной коллекции.

Пример . Проводят подбор штамма, обладающего признаками патогенности. Кроме того, доцолнительно определяют его вирулентность для мышей, для чего определяют патогенные свойства выделенных стафилококковых культур. Затем, в случае слабо выраженной вирулентности возбудителя, проводят серию пассажей на мышах для ее повышения. Для пассироваиия су« точную бульонную культуру стафило-. кокков вводят мыаам интраорбитально. Через 48 ч после эаряжения производят высев из почки выраженных мышей на желточно-солевой агар, вы» росшие колонии засевают на мясо-пентонный бульон, суточную культуру применяют для следующего пассажа.

Вирулентность пассированных штаммов определяют также путем интраорбитального заряжения мышей с последующей фиксацией их гибели. Исходная культура вызывает гибель 10-20% зараженных мышей, тогда как после

959787

6 пассажей она обусловливает падеж

80-.90% животных, После этого определяют наличие ,серологических связей данного штамма с основными патогенными культура ми международного набора Pi(V.et, для чего вирулентный штамм патогенного стафилококка испытывают в реакции агглютинации на стекле с типовыми адсорбированными сыворотками, полученными к основным патогенным культурам этого набора. Вирулентный для мышей штамм патогенного стафилококка, имеющий общие антигены с основными культурами международного набора (в титре 1:1280 и выше), используют для приготовления вакцин, для чего суточную бульонную культуру стафилококка засевают во флаконы с

I о бульоном и инкубируют 16 ч при 37 С.

Бульонную культуру центрифуги- 20 руют 30 мин при 3000 об/мин, готовят суспензию в физиологическом растворе, содержащую 6 млрд, микробных тел в 1 мл, добавляют к ней формалин в количестве 1%, выдерживают 25

24 ч при комнатной температуре, периодически взбалтывая, после чего делают посевы на МПА для контроля стерильности.

Приготовленной вакциной иммуни- 30 зируют кроликов, для этого вакцину

l вводят в краевую вену уха в нарастающих дозах (0,5-1,0:1,5-2,0 мл извести густотой 1 млрд. микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту) по 4 дня подряд с последующим трехдневным перерывом (всего 4 цикла). На 9-12-ый день после последней инъекции делают пробное взятие крови сыворотку отделяют. 4р декомплементируют получасовым прогреванием при 56 С и определяют титр агглютининов к гомологичному штамму в реакции агглютинации на стекле.

Если титр 1:1280 и выше, то кроликов обескровливают. Затем проверя45 ют способиость иммуносыворотки реагировать со всеми культурами международного набора, с этой целью полученную сыворотку с титром

1:2560 проверяют в реакции агглютина-50 ции с эталонными штаммами патогенного стафилококка Staph. anreus (I, И, В, 6,7,9,10,11,13,14,15,16, 17,18, СК-3) и штаммами непатогенного стафилококка Staph.epidermidis 55 (52186, 52260) международного .набора PiCEet. Все основные и ЗОВ дополнительных культур этого набора работают в титрах от 1:160 до 1:2560, а .непатогенные культуры полученной 6р сыворотки не агглютинируются.

Затем проводят диагностику исследуемых микроорганизмов.

Содержание патогенных стафилока ков в молочных продуктах с использованием иммунной сыворотки, полученной но предлагаемому способу, определяют непрямым методом люминесцирующих антител. Препараты для люминесцентного исследования готовят из молока, сливок, сметаны. Материал наносят на хорошо обезжиренное предметное стекло пастеровской пипеткой. После подсушивания иа воздухе препараты фиксируют в течение

10-15 мин путем погружения в ста-, канчик со смесью Никифорова.

Перед использованием в работе устанавливают рабочее разведение люминесцирующей сыворотки и проверяют ее специфичность. Рабочее разведение сыворотки устанавливают путем определения красящего титра предельного разведения сыворотки, при котором происходит достаточно яркое иммуноспецифическое окрашивание клеток патогенных стафилококков. Рабочее разведение обычно устанавливают в два раза ниже красящего титра °

На фиксированные и высушенные мазки, приготовленные из образцов молочных продуктов, наносят полученную иммунную сыворотку в рабочем разведении (1:64). Препараты помещают на 15-20 мин во влажную камеру. Затем капли иммунной сыворотки осторожно стряхивают, а мазки промывают физиологическим раствором и высушивают на воздухе. После этого на препараты наносят по каплям люминесцирующую сыворотку в рабочем разведении (1:32). Окраску производят в течение 15-20 мин во влажной камере.

По окончании окраски мазки тщательно промывают физиологическим раствором, подсушивают и просматривают под люминесцентным микроскопом. Для снятия неспецифического свечения фона в препаратах из молочных продуктов люминесцирующую сыворотку перед нанесением на мазки смешивают с раствором бычьего альбумина, окрашенного родамином в соотношении 1:1. Для оценки интенсивности свечения используют четырехкрестовую систему.

Результат исследования считают положительным в случае яркой люминесценции по периферии микробной клетки.

С помощью иммунной сыворотки, полученнс1й предлагаемым способом, .в ис-. следуемом материале четко определялись стафилококки, относящиеся к группе патогенных, тогда как непатогенные стафилококки не реагировали с приготовленной.иммуносывороткой.

Предлагаемый способ получения иммунной сыворотки позволяет расходовать на работу, как минимум, в 13 раз меньше кроликов, значительно сократить количество питательных сред и времени, затрачиваемого на исследо959787

Формула изобретения!

Составитель С.Малютина

Техред М.Рейвес. ф

Корректор Г.Решетник

Редактор Н.Лазаренко

Заказ 7084/8 Тираж 714

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП Патент, r. ужгород, ул. Проектная, 4 ванне, а также проводить анализ продуктов непосредственно с помощью люминесцентной микроскопии, без количественных высевов и выделения чистых культур стаФилококков, что особенно важно при работе в условиях производства молочных продуктов.

Способ получения иммунной сыворотки для выявления патогенных стафи лококков в молочных продуктах, включающий отбор штамма стафилококка, обладающего признаками патогенности, с последующей иммунизацией отобранным штаммом кроликов, забором крови и отделением сыворотки, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения способа, иммунизацию проводят штаммом стафилококка, обладающим одновременно признаками патогенности, вирулентности и антигенной общности со всеми штаммами стаФилококков международной коллекции.. Источники инФормации принятые во внимание при экспертизе

1.Светина В,В. Серологическое типирование стафилококков. Канд. дисс. M. 1974.