Способ определения видовой принадлежности водных организмов
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
Союз Советских
Социалистических
Республик
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(61)Дополнительное к авт, сеид-ву(22) Заявлено 2б.12.80 (21)3225401/28-13 (51) М.КИ. сприсоединением заявки Йо(23) Приоритет
A 0i К б1/00
ГосудврственнмЯ коинтет
СССР по долви нзобретеннЯ н отнритнЯ (53) УДК б 39 ° 4 ° 05.(088.8) Опубликовано 0703.83. Бюллетень Ì9 9
Дата опубликования описания 070333
Л.М. Эпйтейн, С.й, Шевцова, Ю.И. Касьйненко, Г.А.Шеядов, Е.В. Розенгарт, E.Á. Майзель и A.Ï. Бресткнн(72) Авторы изобретения
l н аучно-и сследов ат ель ский ин с . хозяйства и океанографии ° - 1 (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ
ВОДНЫХ ОРГАНИЗМОВ
Изобретение относится к области рыбного хозяйства, а именно к спосо. . бам определения видовой прикадлежности моллюсков преимущественно кальмаров, и может быть использовано для организации рационального промысла этого вида моллюска и воспроизводства вида.
Известен способ определения вид@вой принадлежности живых организмов, предусматривающий связывание аитигенных белков с антителами 11.
Однако этот способ требует больших затрат времени и трудно воспроизво- :. дим.
Наиболее близким к изобретению является способ определения видовой принадлежности моллюсков по формологии и биохимическому признаку, включающему исследование свойств ферментов 21.
Согласно этому способу для определения видовой принадлежности используют электрофореграмьм энзимовэлектрофоретические подвижности ферментов при их разделении.в электрическом поле на различных носителяхагар-агаре, полиакриламидном геле, крахмале.
Однако способ технически сложен из-з а многочисленных подготовительных операций к эксперименту и самого эксперимента, требующего дефицитных реактивов.
Кроме того,.он имеет низкую воспроизводимость из-за многочисленных операций по подготовке эксперимента, в связи с чем обработка результатов весьма сложная.
Цель изобретения - упрощение и удешевление способа, повышение воспроизводимости результатов и точ, ности определения.
Для этого в известном способе определения-видовой принадлежности водных организмов, преимущественно кальмаров по морфологии и биохимическим
2О признакам, включающим исследования свойств ферментов, для исследования свойств ферментов готовят гомогенат тканей и растворы субстратов для ферментов, содержащихся в этих тканях, проводят гидролиз субстратов под действием ферментов и строят кривые гидролиза — графики субстратной специфичности, по которым находят кинетические параметры гидролиза — оптимальную концентрацию субстрата, константу Михаэлиса, максимальную и
1001898 относительную скорости гидролиза, а определение видовой принадлежности осуществляют путем сопоставления этих данных с заранее полученными аналогичными показателями, специфичными для каждого вида организмов.
Кроме того, проводят исследования субстратной специфичности холинэстеразы или фосфатазы, а в качестве источника ферментов использукт гомогенаты тканей гачглиев или гонад. . 10
Способ заключается. в следующем.
Готовят гомогенат соответствующей . ткани для исследования: гомогенат оптических ганглиев кальмаров для определения свойств холинэстераз и фосфатаз и гомогенат гонад для изучения свойств фосфатаз.
Готовят растворы соответствующих субстратов для каждого из ферментов: холиновые эфиры уксусной (ацетилхолин), припионовой (пропионилхолин) и масляной (бутилхолин) кислот для холинэстераз и фосфорные эфиры: X— глицерофосфат, Р глицерофосфат и фенилфосфат — для фосфотазы.
Измеряют скорость гидролиза этих субстратов под действием фермента гомогенатов тканей при различной концентрации субстрата, для чего. в термостатируемую кювету вносят последовательно соответствующие буферные растворы, гомогенаты тканей и растворы субстратов.
Измеряют и рассчитывают кинетические параметры холинэстеразного и фосфатазного гидролизов, для чего строят график субстратной специфичности на основе измерения r:àòàëè÷åcкой активности ферментов при различных кОнцентрациях субстратов, (так называемые кривые гидролиза субстра- 40 тов — зависимость
Находят кинетические параметры гидролиза: оптимальную кон ентрацию субстрата(Яопт ), которая равна концентрации субстрата, соответствующей оптимальному значению скорости, величину константы Михаэлиса(м) максимальную скорость гидролиза(Ч „)
50 согласно общепринятым методам ферментативной генетики из уравнения
Михаэлиса-Ментена, и относительную скорость гидролиза (Чот„ )
Вычисление величинй относительной 55 скорости гидролиза (Ч н ) проводят из сравнения данных g для каждого из субстратов,. условно принимая 3 x субстрата, гидролизующегося с наибольшей скоростью, за 100%. 60
Полученные данные являются специфичными для каждого вида кальмаров, поэтому в дальнейшем, проводят изучение кальмаров, выловленных.во время промысла или научно-исследовательски-g5 ми судами по данной методике, и сравнивая вновь полученные данные с уже известными, можно с точностью определить видовую принадлежность особи.
Пример 1. Уточняли видовую принадлежность выловленного кальмара с помощью -изучения свойств холинэстеразы.
Активность холинэстеразы определяли методом непрерывного потенциометрического титрования 0,02 молярным раствором NаОН кислоты, выделяющейся при гидролизе субстрата при постоянных рН 7,5 и температуре 25 С в присутствии 0,1 М KCI. Контроль рН осуществляли при помощи стеклянного электрода, подключенного к высокочув твительному (pH 262) потенциометру.
Электродом сравнения служит хлорсеребряный электрод. Постоянную температуру (25 ) реакционной среды поддерживали ультратермостатом, подсоединенным к кювете для титрования. За единицу активности (Е) принимали такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мк моля субстрата в минуту при стандартных условиях, Перед опытом ткань дефростировали на воздухе и гомогенизировали в таком объеме воды, чтобы конечная концентрация равнялась 10 мг/мл.
В стеклянную термостатируемую кювету вносили пипеткой последовательно 1 мп 7 10 М фосфатного буфера с рН 7,7, 0,2 мп гомогената ткани оптического ганглия кальмара с 1 мп 1М раствора КС1, определенное количество дистиллированной воды — до общего объема пробы 10 мп с учетом добавляемого в последнюю очередь объема субстрата. Смесь тщательно перемешивали магнитной мешалкой в течение 1-2 мин, доводили рН реакционной смеси 0,02М
Na0H до.7,5 и затем вносили субстрат, причем объем добавляемого раствора субстрата рассчитывали таким образом, чтобы конечная его концентрация быпа равна той, которая необходима для опыта. Образующаяся в ходе ферментативного гидролиза субстрата кислота была оттитрована 0,02N раствором йаОН, Щелочь добавляли в реакционную смесь из бюретки небольшими порциями (по 1 см), в котором содержалось
5,2 мкл щелочи через фиксированные промежутки времени (6) 0,02М NaOH добавляли с таким расчетом, чтобы колебания стрелки не превышали
0,1 рН от заданной величины 7,5.
Время начинали отсчитывать в момент добавления 1 см щелочи, отсчет заканчивали тогда, когда стрелка достигала заданной величины рН (7,5) .
Для определения среднего значения опыт проводили 5- 7 раз . Полученную
1001898 среднюю величину вводили в формулу расчета удельной активности.
Скорость гидролиэа определяли в широком диапазоне концентрации субстратов: от 5-10 м до 5 ° 10 a N. В качестве субстратов использовали стан- . дартные холиновые эфиры карбоновых кислот в форме иодидов, растворенных в дистиллированной воде: ацетилхолин (Ax), бутирилхолин (ByX), гропионилхолин (Пх), мехолин (ацетил- В-метилхолин) и один не холиновый эфирйодметилат - ацетотиэтилпиперидиния (ИЭИ).
Кинетические параметрыг константу
Михаэлиса и максимальную скорость 15 гидролиза рассчитывали по методу Лайнуивера и Берка, а удельную активность по формуле:
M Q
20 где A — удельная активность, Е/мл, . Я - нормальность раствора щело ц количество щелочи, затраченной íà титрование,моль, 25
Ve — количество анализируемого раствора фермента в реакционной смеси, мл, — продолжительность ферментативной реакции, мин. 30
Ф
При расчете скорости реакции учитывали спонтанный (самопроизвольный) гидролиз субстрата.
Удельную активность ткани рассчи- 35 тывали по формуле: где A - удельная активность, Е/мл, С вЂ” концентрация ткани в гомоген ате, мг/мл . по полученным данным измерения 40 скорости гидролиэа при различных кон центрациях стандартных субстратов строят график Субстратной специфичности (график 91) и находят Кщ, Ч„„о„ бои Ь отн (та"л 91) °
"изучение морфологических призна- 45 ков и биохимии позволили сделать вывод относительно того, что выловленный кальмар является новозеландским (Nototoda rus S1oan i 51oan i } . . Пример 92. Уточняли видовую 50 прин адлежность выловленного кальмара с помощью изучения свойств холииэстеразы по методике, описанной в примере 91.
Морфологические и биохимические 55 признаки свидетельствуют о том, что этот кальмар относится к другому виду — командорскому (Berгуtenthis magis ter) (график 92, табл. 91).
Пример 3. Проводили опреде- щ ление видовой принадлежности кальмара с помощью фосфатаэы ганглиев.
Активность Фосфатазы определяли по модифицированному методу Боданского, при котором образующиеся при гид- 5 ролизе эфиров ортофосфорной кислоты фосфаты при взаимодействии с молибдатом аммония образуют соли гетерополикислот, восстанавливающиеся амидолом до молибденовой сини, обладающей яркой синей окраской с максимумом поглощения в зоне 750 нм. Оптическую плотность молибденовой сини определяли с помощью фотоэлектроколориметра ФЭК-б0, светофильтра 9 7 при длине волны 750 нм или с помощью спект-. рофотометра СФ-26 при длине волны
750 нм. Калибровочную кривую строи- ли, используя в качестве источника фосфата водный раствор КН РО4.. Исходный раствор содержал в 1 мл 50 мкг Р.
Количество фосфата в пробе изменяли от 2,5 до 45 мкг. За единицу активности принято такое количество фер« мента, которое образует при гидролизе соответствующего субстрата за 1 ч при 30 1 мкмоль Р.
Перед опытом ткань дефростировали на воздухе, после чего ее гомогенизировалн в 9 объемах 0,1М хлористого калия: конечная концентрация ткани
С=100 мг/мл. Активность определяли в широком диапазоне рН (от 2 до 10), которое поддерживали буфером 0,2М глицин — оу2Н НС1 или 0,2М глнцин — 0,2М йаОН, содержащим для стабилизации фермента 1 10 l раствор хлористого. магния. В качедтва субстратов использовали отечественные коммерческие препараты — эфиры ортофосфорной кислоты: два алифатических эфира - глицерофосбаты с различным расположением сложно-эфирной фосфатной группы, а(. и изомеры ф- глицерофосфат натрия, а — глицерофосфат натрия и ароматический.. эфир-фенилфосфат натрия. Исходные растворы субстратов — фенилфосфата натрия в концентрации 1 ° 10 М и а и р глицерофосфаты — 3 10 "М готовили на воде (с последующим доведением рИ раствора до соответствующего для опыта значения 0,2М раствором НС1 или
0,2М раствором Каон).
Для каждого опыта готовили 3 пробы: первая (первый контроль) служит контролем на самопроизвольный (спонтанный) гидролиз используемого субстрата - к 0,5 мл буфера добавляли
0,5 мл водМ, вторая (второй контроль) является контролем на содержание фосфора в исходной ткани - к 0,5 мл буфера добавляли 0,5 мл Н О и 0,5 мл гомогената, третья - рабочая - к
0,5 мл буфера добавляли 0,5 мг гомогената., Удельную активность измеряли при оптимальной концентрации субстратов - 3. 10Г М.
2.
Пробы инкубировали 15 мин при 30 в термостате, а затем через равные промежутки времени (1 мин) в первый контроль и рабочую пробу добавляли по
1001898 после вычета суьвы количества P первого и ssopoi
ro контроля, 2 - время инкубации, ч, 0,5 — количество внесенного гомогената, мя.
По данным измерения скорости гид- ролиза при различных концентрациях субстратов строили график субстратной специфичности (график 3) и находили Км о У о /go (Ta6a
Морфологические и биологические показатели.свидетельствуют о том, что данный кальмар является новозеландским (Nototod3 rus 5 lodn i 5 lodn I) .
Пример- 4. Уточняли видовую принадпежность кальмара по методике, описанной в примере 93.
Исследования морфологических признаков и биохимии показали, что этот кальмар относится к другому виду - командорскому (Berryteuthls mogister) график 94, табл. 92 °
При отличии биохимических признаков кальмара от выше приведенных констатируют, что данная особь не относится к уже изученным видам по биохимическим признакам и имеет свой таксономический статус, а полученные для данной особи показатели будут в дальнейшем являться критериями сравнения для других изучаекнх кальмаров.
С помощью предлагаемого способа можно определять те промысловые виды кальмаров, морфологическое определение .которых затруднено, что имеет большое значение в промыленном рыболовстве в связи с запреТом перелова каждого отдельного вида кальмара.
0,5 мл субстрата, предварительно нагретого до 30 и инкубировали далее все три пробы в течение 2 ч, после чего реакцию останавливали введением в каждую пробу последовательно по
0,5 мя 30%-ной трихлоруксусной кислоты через те же промежутки времени (1 мин). Смесь центрифугировали на настольной цЕнтрифуге ЦУМ-1 при комнатной температуре в течение 15 мин при и =5000 об/мин., после чего 10
0,5 мя надосадочной жидкости добавляли к 3,5 мл воды, туда же вносили
0,6 мя 2,5%-ного раствора молибдата аммония,в 6МН450 и 0,4 мя 0,5%-ного раствора амидола в 5%-ном растворе 15
Na Скорость гидролиэа (Ч ) рассчитывали по формуле: Чт 1 ?- oq ъ1 число, которое показывает,, какую часть от общей смеси брали на фотометрирова-30 ние после центрифугирования (0,5 мя иэ 2 мп смеси); где 4 31 - количество фосфора неорга киче ского (мкмоль ), о бр азовавшегося в процессе ферментативной реакции Т а блиц а 1 Оптимальная концентрация субстрата )Sl опт 10 у М Константа Михаэлиса 10, i! коман- ново- командорс- зеланд.. дорск. кий новозеланд ново- команэеланд. дорск. 0,24 1,4 A?l 10 0 ПХ 80 БУХ 81 Г .e?: 40 ПЭ? 44 100 0,7 3 0,5 0,8 0,5 2 0,15 0,13 0,15 0,15 0,35 50 0,4 5 3 70 2 5 40 0,9 0,2 100 20,0 100 1,8 0,22 Относительная скорость гидролиза при $5 J опт. Суб- ново- команстр. эелан. дорск. Удельная активность Е/мг исх.тк. 1001898 Таблица 2 Относительн. скорость гидролиза (%) Вид кальмара Константа ?3нхазлиса (Кт, мИ) Максимальная скорость гидролиэа мкмоль (— — — — — -) час мт вл.тк ф"ф 4глиц. Р-глиц ф-ф А-глиц. -глиц. ф-ф -глиц. Р-глиц Командорский (В.magister) 40 0,05 0,01 0,02 11,0 26,0 25,0 100 20. Новозеландский (N.S loan 1 51оан 1 ) 58 0,085 0,03 0,05 10,0 40,0 22,0 100 35 Формула изобретения 1. Способ определения видовой принадлекности водных организмов, преимущественно кальмаров по формологин ,к биохимическим признакам, включаю- Я а им исследование свойств ферментов, о т л и ч а в шийся тем, что, с ° целью упрощения н удешевления способа, повышения воспроизводимости результатов и точности определения, ЗО для исследования свойств ферментов готовят гомогеиат тканей и раствори субстратов дпя ферментов, содерхащнхся в этих тканях, проводят гидролиэ субстратов под дЕйствием ферментов . н строят кривые гидролиза - графики субстратной специфичности, по которым находят кинетические параметры. гидролиза - оптимальную концентрацию субстрата, константу Иихаэлиса, максимальную н относительную скорости гид- ролиза, а определение видовой принадлежности осуществляют путем сопоставления этих данных с заранее полученными аналогичными показателями, специфичными для каждого вида органкз- 45 мов. 2. Способ no n.1, о т л и ч а в° ° ° ° ° ° и и с я тем, что проводят исследданйя субстратной специфичности холинэстеразы. 3. Способ по п.1, о т л и ч а в - шийся тем, что проводят исследования субстратной специфичности фосфатази. 4. Способ по пп.1-3, о т л и ч ак шийся тем, что для нсследовакия используют гомогенаты тканей ганглиев и гонад Источники информации, принятые во внимание при эксйертиэе 1. Рычков Y). Ã. Особенности серологической дифференциации народов Сибири. "Вопросы антропологии", 1965, в 21, с. 18-33. 2 ° Логвиненко B.Y.. н Кодолова О.П, О возмохности дифференцирования видов двухстворчатых моллюсков путем сравнения электрофореграмм ьмаечных воднораствориьых белков. "Зоологический хурнал", L 50., 9 6, 1971, с. 923925. 1001898 з г — 1у кониентраиии субстраяа Фиг./ Ксиандорский капьиар s г - tg кониенврации субстрата ФиаГ 1001898 НооОЗЕЛандСкий pam о аа :3 Квмандврский В /0 Фени л(рос рая фВ0 Ф,д у ь ф 40 Р-глицерорасрав ,ф 3 20 Я-глицероросрав 25 2 /У / Отрииавельныйлогари рм кониеняраиии субстрата Фиг.4 Иа Составитель С.Филиппова Редактор Е. Хейфиц:Техред. Т.Иаточка Корректор И. Демчик Заказ 1669/1 Тираж 719 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д.4/5 Филиал ППП "Патент", r.Óæãîðîä, ул.Проектная, 4 9 3 /00 ф Ф 80 б0 а 40 43 Ф. я ZS Z /5 / Отрицательный noaapu í канценврацаи субстрава Фиг. В
