Способ получения диагностикума

 

(72) Авторы изобретения

E.Ï. Москаленко, В.M. Лубэ и Н.К. Литвинов

Ростовский ордена Дружбы народов медицинский институт (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУИА

Изобретение относится к области медицины и может найти применение в лабораторной диагностике коклюша,особенно при индикации бессимптомных или клинически слабо выраженных форм инфекции. 5

Известен способ получения коклюшного антигенного диагностикума путем обработки формалинизированных эритроцитов танином с последующей сенсибилизацией их антигеном и фиксацией формальдегидом 1 1

Однако известный способ недостаточно чувствителен.

Целью изобретения является повышение чувствительности диагностикума.

Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа формалинизированные эритроциты сенсибилизируют антигеном и фиксируют формально дегидом.

Отличительной особенностью способа является то, что эритроциты до сен" сибилизации обрабатывают ультразвуком

2 при частоте 42-50 кГц и амплитуде 6080 мкм в течение 5- 15 мин, а сенсилилизацию осуществляют при ультразвуковом воздействии в том же режиме в течение 1-3 мин в начальный период контакта эритроцитов с антигеном.

Способ осуществляется следующим образом. формалинизированные эритроциты барана отмывают от формальдегида нейтральным (рН 7,0-7,2) стандартным солевым раствором, содержащим 0,853 хлорида натрия (NaC1) и 0,45"; натрия лимоннокислого трехзамещенного (СЬН О.. 3Н О) . Полученный эритроци" тарный осадок ресуспендируют в стандартном солевом растворе, готовят 5-

15/ эритроцитарную взвесь и подвергают ее ультразвуковому воздействию (частота 42-50 кГц, амплитуда 6080 мкм, экспозиция 5-15 MHH). Обработанные ультразвуком и однократно отмытые стандартным солевым раствором формалинизированные эритроциты соедиТабл и ца 1

Активность диагностикумов в РПГА

Наименование агента воздействия

Характер воздействия на формалинизированные эритроциты с паракоклюшной а гглютин и рующей сывороткой с коклюшной агглютинирующей сывороткой

1,4+п,13

3,07+0,22

Химическое

Таниновая кислота

5,20+0,25 3,13+0,30 физическое

6,42+0,16

Ультразвук

3,21+0,18

П ри ме ча ни е: активность диагностикумов представлена в 1 Х геом. р 95 обратных величин титров коклюшной и паракоклюшной агглютинирующей сыворотки.

3 1001 няют с ультразвуковым антигеном, смесь подвергают воздействию ультразвука в течение 1-3 мин. Последующий контакт антигена с эритроцитом осуществляют при температуре 37 С в течение 1-2 ч. s

Затем в получаемый препарат добавляют формальдегид (1i) хранение готового препарата осуществляют в присутствии формальдегида.

Контрольный препарат готовят анало- гичным образом, исключая сенсибилизацию эритроцитов коклюшным антигеном.

Способ поясняется следующим примером.

Пример. Эритроциты барана кон-15 сервируют формальдегидом по методу

Чизмеса в модификации М. И. Леви с соавт. (1965).

Для получения антигенов используют культуру Bordetella pertussis 20 штамм 305, выращенную на кузеиновоугольном arape (среда КУА) при температуре +36 С в течение 72 ч. Выращенные микроорганизмы собирают с питательной среды, суспендируют в стериль- 25 ном 0,85 -ном растворе хлорида натрия рН 7,0-7,2, доводят густоту микробной извести до 1500 MEM в 1,0 мл по оптическому стандарту Государственного контрольного института меди- ЗО цинских биологических препаратов им.

Jl.À. Тарасевича. Микробную взвесь дезинтегрируют ультразвуком (частота

42-50 кГц, амплитуда 60-80 мкм, экспозиция 10- 15 мин), антиген отделяют центрифугированием при 18000 об/мин, в течение 60 мин при- +5 С.

Для получения диагностикума

504-ные формальнизированные эритроциты отмывают нейтральным стандартным солевым раствором (1440 g, 2-3 мин), доводят эритроцитарную взвесь до кон940 4 центрации 5-15 и подвергают ультразвуковому воздействию (частота 4250 кГц, амплитуда 60-80 мкм, экспозиция 5- 15 мин). Затем эритроциты от" мывают стандартным солевым раствором, ресуспендируют и к суспензии эритроцитов добавляют антиген в дозе 510 мкг по белку на 1,0 мл эритроцитов и смесь дополнительно подвергают ультразвуковому воздействию в течение 1-3 мин.

Экспозиция сенсибилизации составляла 1-2 ч при температуре +37 С, для о стабилизации готового препарата добавляют 13 формальдегида. По окончании процесса проводят отмывание эритроцитарного диагностикума от излишков и связанного антигена. Хранение препарата осуществляют в присутствии

14 формальдегида.

Активность контрольных препаратов, а также опытных диагностикумов, приготовленных при воздействии на эритроциты таниновой кислоты (по способу прототипа), а также предлагаемым способом при ультразвуковом воздействии сенсибилизируют ультразвуковым кок-: люшным антигеном и исследуют в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), параллельно с реакцией торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА).

Кроме того, специфичность исследуемых диагностикумов проверяют при постановке РПГА с гетеролсгичной (паракоклюшной) системой.

В табл. 1 представлены опытные данные по изучению активности и специфичности диагностикумов, полученных при действии таниновой кислоты и ультразвука, с целью повышения гемосорбционной активности формалинизированных эритроцитов барана.

Таблица 2

Активность диагностикумов в РПГА

Воздействие УЗ в процессе гемосорбции

Наименование

Характер воздействия на формалинизиро" рованные эритроциты барана агента воздействия с паракоклюшной агглютинирующей сывороткой с коклюшной агглютинирующей сывороткой

15+0,26

1,20 0111

3,07+0,17

3,28 0,09

Химическое Таниновая кислота

3,14+0,28

5,20+0,25

5, 51+0, 28

5,96+0,16

6,42+0,23

3, 16+0, 19

3, 21+0, 18

3,22+0,19

Физическое

Ультразвук

11»

«11»

П р и и е ч а н и е: активность диагностикумов представлена в 1g Х геом.

Анализ полученных результатов сви50 детельствует о возрастании специфической активности диагностикумов (Р

<0,05), полученных при дополнительном ультразвуковом воздействии в начальный период контакта антигена с .эрит. роцитами, обработанными ультразвуком.

Таким образом, способ позволяет получить диагностикум высокой активности и cclpöè è÷íîñòè.

Формула изобретения

Способ получения диагностикума путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов антигеном и фиксации формальдегидом, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения чувствительности диагностикума, эритроциты до сенсибилизации обрабатывают ультразвуком при частоте 42-50 кГц и

S 1001940 б

Анализ полученных результатов сви- сывороткой, при постановке РПГА с repeyenbcxsyex о значительном повыше- терологичной (паракоклюшной) сЬворотнии специфической активности диагнос- кой активность диагности,.умов была в тикумов, полученных предлагаемым спо- 800-3000 раз ниже 0,01 Р 0,02. собом по сравнению с прототипом Кроме того, кратковременное приме(0,0%&0,05) ° нение ультразвука s начальный период

Данные РТПГА и перекрестной РПГА сенсибилизации эритроцитов ультразвус паракоклюшной агглютинирующей сыво- ковым коклюшным антигеном позволяет роткой позволяют отметить "высокую повысить специфическую активность поспецифичность диагностических прела- >4 лучаемого диагностикума и увеличить ратов, приготовленных предлагаемым эффективность способа в результате способом, по сравнению с прототипом. более равномерного распределения анДанные эритроцитарные ультразвуковые тигена, улучшения условия контакта диагностикумы имели высокие титры в антигена и эритроцитов и возможной

РПГА (до 1:9,6 млн) лрй постановке 1% активации антигена под действием ультреакции с гомологичной (коклошной} развука (табл. 2) .

Составитель Г. Крюкова

Редактор Н. Аристова Техред К.Мыцьо Корректор Е. Рошко

Заказ 1674/2

Тираж 711 Подписное

ВНИИЛИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

7 1001940 8 амплитуде 60-80 мкм в течение 5-15 мин Источники информации, а сенсибилизацию осуществляют при принятые во внимание при экспертизе ультразвуковом воздействии в том же режиме втечение 1-3мин вначальный пе- 1; Каральник В.В. Эритроцитарные риод контакта эритроцитов с антигеном. и диагностикумы. 1976, с. 84,