Способ подготовки биологических объектов к электронно- микроскопическим исследованиям

 

Оп ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 1004805

Ф (C

- C 2 ь > г (61) Дополнительное к авт. свил-ву— (22)Заявлено 2б.06.81 (21) 3314623/28-13 (51) М. Хл.

G 01 М 1/28 с присоединением заявки №вЂ”

Гасударственный квинтет (23) Приоритет

Опубликовано15.03.83. Бюллетень №10

Дата опубликования описания 15. 03 83 (53) УД К 616-07 (088.8) пе аелзи нзобретеннй н атхрытий (72) Авторы изобретения

Б. А. Скорняков и Т. П. Говоруха

Институт проблем криобиологии и криомедицины

АН Украинско" CCP (71) Заявитель (54 ) СПОСОБ ПОДГИБ)ТОВКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

К ЗЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКИМ ИССЛЕДОВАНИЯМ

Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к способам подготовки биологических объектов к микроскопическим исследованиям.

Известен способ подготовки биоло5 гических объектов для изучения реакции их структур на действие криопротекторов с помощью электронной и оптической микроскопии заключающий1 0 ся s том, что перед фиксацией объекта из среды инкубирования удаляют криопротектор и используют фиксатор в обычной физиологической среде 1 ), 15

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ подготовки биологических объектов к электронно микроскопическим исследованиям, 20 включающий их инкубацию в криопротекторе, отмывку буфером, фиксацию, обез воживание и заключение в отвердевающий материал 1 2 j.

Недостатками способа являются разрушение части клеток при их отмывании от криопротектора; изменение фор мы клеток и других морфологических параметров. Зто связано с действием двух групп факторов: остаточные явления после инкубации с криопротектором и его отмывки; осмотические явления при быстром (при медленном) удалении криопротектора из окружающей среды.

Целью изобретения является сохранение морфологических признаков биологических объектов в процессе подготовки их к микроскопическим исследованиям.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу подготовки биологических объектов к электронно-микроскопическим исследованиям, включающему их инкубацию в криопротекторе и отмывку буфером, фиксацию, обезвоживание и заключение в отвердевающий материал предложено отмывку провоI

05 4 вет с т вует ни предполагаемой реакции клеток на действие этиленгликоля высокой концентрации, ни их активному состоянию.

По предложенному способу клетки в результате физико-химического воздействия приобретают сферическую форму.

Следовательно, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет устранить осмотически обусловленные артефакты препарирования и сохранить морфологические параметры объекта неизменными в течение всего процесса подготовки образца.

Формула изобретения ром, 40

Для трансмиссионной электронной микроскопии после отмывки осуществляют постфиксацию в растворе осмия по классичес.кой методике с последующим обезвоживанием в этаноле и

=.аключением в эпон.

Для ".равнения осуществляют обработку эритроцитов крови человека †.ред"àãаемым способом и известным.

По известному способу имеют место осiàòo÷íûå явления действия на эритроциты этиленгликоля и процесса отмывки, что влияет на степень сохра -:ности клеток. Эритроциты приобретают промежуточную форму между эхиноцитами и дискоцитами, что не соотВНИИПИ Заказ 1869/52 T

3 10048 дить 40"-ным раствором этиленгликоля в 0,1 М Фосфатном буфере, фиксировать в 2":-ном растворе глутаральдегида на 0,1М осфатном буфере, содержащем 40>. этиленгликоля, далее вес-и промь вание в ряду растворов этиленгпиколя на 0,1М фосфатном буфере с нисходящей концентрацией 40-0х при изменении концентрации в каждом последующем растворе на 10ь и отмыв- ð кой чистым 0,1М фосфатным буфером.

Пример. Эритроциты после инкубирования с 402 этиленгликоля охлаждают до 0 С и отмывают от белков плазмы путем центрифугирования при 5000 об/мин s, 5 мин и замены среды инкубирования на 40 -ный раствор этиленгликоля в

0,!М фосфатном буфере.

Отцентрифугированный осадок клеток заливаloT пятикрàTным объемом фик- go сирующего раствора 2 -ного глутаральдегида на 0,1М фосфатном буфере, содержащем 40;- этиленгликоля, рН раствора 7,3, осмолярность по буферу о

300, температура фиксации клетки 0 С в течение 1 ч отмывают в ряду растворов =->òèëeíгликоля на 0,1М фосфат ном буфере нисходящей концентрации

40-Oi при изменении концентрации в каждом последующем растворе на 101.

Скор --..ть центрифугирования 1000 об/мин

i3 чистом 0>1М фосфатном буфере клетки отмывают дважды.

Для растровой электронной микроскопиии к>летки обезвоживают в ряду

35 растворов этанола восходящей концентрации, после чего суспензию наносят на предметный столик, подсушивают и напыливают в вакууме серебСпссоб подготовки биологических объектов к электронно-микроскопическим исследованиям, включающий их инкубац:ю в криопротекторе, отмывку буфером, фиксацию, обезвоживание и заключение в отвердевающий материал, отличающийся тем, что, с целью сохранения нативных морфологических признаков, OTMblвку проводят 40 -ным раствором этиленгликоля в 0,1 М Фосфатном буфере, фиксируют в 2х-ном растворе глутаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере, содержащем 40 этиленгликоля, далее ведут промывание в ряду растворов этиленгликоля на 0,1 М

Фосфатном буфере с нисходящей концентрацией 40-Oi при изменении концентрации в каждом последующем растворе на 10 и отмывкой в чистом

0,1 М фосфатном буфере.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Lens Н. The Freez1по thresnola

peripheral moter nerves following

pretreatment with dimethyl sulfoxide

and е .hanoi: an electrophysiologic anc

electron microscopic study on the

sciatic nerve rabbits.- Cryobiology "

1977 14> р.215-227 °

2. А!ink G.Ì. The effect of cooling rat.e and dimenthyl su1foxide concentration on the ultrastructure of

neonatal гас heai cells after fråå» >l

zing and thawing; Cryobiology, 1976, 13,Н 3, р.305-316 (прототип) . ираж 871 Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4