Способ определения изоферментной активности гликогенфосфорилазы

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОфЕРМЕНТНОЙ АКТИВНОСТИ ГЛИКОГЕНФОСФОРИЛАЗЫ путем электрофоретического разделения пробы на поддерживающей среде с проявлением в буфере и опре делением активности изоферментов спектрофотометрически, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени определения изоферментной активности, разделение ведут в трйс-веронал-мединаловом -буфере на ацетатцеллюлозной пленке, а в качестве проявляющего буфера используют фосфатный буфер, содержащий . 292,0 - 292,5 - 1(Г гликогена, 18 20-10 % адемин-5-фосфата натрия, 64-67 глюко-1,б-дифосфата, 31-33 сульфата магнезии, 80 90 ед./л глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы . 40-50.ед/л фосфоглюкомутйзы, 6,4-6,6 10 М никотинамиддинуклеоi тидфосфата натрия и 31-33 1(ГМ этилендиаминтетрауксусной 1 ислЬ (Л ты.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

CNNVN

РЕСПУБЛИК,„SU„„ 1 008655 . A

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

М АВТОРГНОМЪ СВИДЙТЕЛЬСТВМ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЦТИЙ (21) 3252582/28-13 (22) 03 ° 03.81 (46) 30.03.83.. Бюл. 9 12 (72) В.Н.Титов, И.К.Филиппов, И.A.Маслова и В.A.Филиппова (71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (53) 616.07 (088.8) (56) 1..Bohm Н., Krause Е.,Will Н.

"Glykogenphosphorylase-6 und isoensyme in der diagnosticdesakuten", Dtsch., Ges 29(1974), 26, 1216

12.21 (прототип) . (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОФЕР

МЕНТНОЙ АКТИВНОСТИ ГЛИКОГЕНФОСФОРИЛАЗЫ путем электрофоретического разделения пробы на поддерживающей среде с проявлением в буфере и опре4 делением .активности изоферментов спектрофотометрически, о т л и ч а— ю шийся - тем, что, с целью сокращения времени определения изоФерментной.активности, разделение ведут в трис-веронал-мединаловом .буфере на ацетатцеллюлозной пленке, а в качестве проявляющего .буфера используют фосфатный буфер, содержащий

292,0 — 292,5 - 10 3М гликогена, 1820 - 10 Ъ аденин-5-фосфата натрия 64-67 ° 1(ГЗМ глюко-1,6-дифосфата, 31"33 ° 10 3М сульфата магнезии, 80

90 ед./л глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. 40-50 ед/л фосфоглюкомутазы, 6,4-6,6 10 М никотинамиддинуклеотидфосфата натрия и 31-33 103М I этилендиаминтетрауксусной кислотые

1008655

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при биохимических исследованиях.

Известен способ разделения изоферментов гликогенфосфорилазы методом диск-электрофореза в геле полиакриламида, согласно которому образец гомогената наносят на поверхность полиакриламидного геля, заполняющего вертикально расположенную стеклянную трубку. Трубку помещают в злектрофоретическую камеру и проводят электрофорез при напряжении 110-120 В силе тока. 6-8 мА в течение двух часов.

Затем полиакриламидный гель выдавливают из трубки и помещают в кювету для окрашивания. Для выявления изоферментов реакцию ведут в сторону синтеза гликогена из глюкозо-1-фосфата, с последующей окраской полисахарида раствором Люголя. После окрашивания на прозрачном фоне геля видны коричневого цвета фракции, которые оценивают в проходящем свете.

Благодаря хорошей разрешающей спо.— собности геля четко выявляется спектр изоферментов гликогенфосфорилазы 1). 25

Недостатком способа является длительность его осуществления (время проведения исследования составляет

24 ч и складывается из времени, затрачиваемого на полимеризацию геля, 30 электрофореза и проведение биохимической реакции, ведущей к образова:нию необходимого количества гликогена продолжающейся 17 и более часов). Изза этого ограничены возможности при- 35 менения данного способа в медицине например, для диагностики инфаркта миокарда, и в эксперименте. Кроме того, осуществление способа ведет к значительным затратам реактивов, так 40 как приходится инкубировать большое количество полиакриламидного геля и использовать значительное количество инкубационной смеси для его погружения и пропитки.

Цель изобретения - сокращение вре-45 мени определения изоферментной активности.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения изоферментной активности глико- 50 генфосфорилаэы путем электрофорети" .ческого разделения пробы на поддерживающей среде с проявлением в буфере и определением активности изоферментов спектрофотометрически,разде- 55 ление ведут в трис-веронал-мединаловом буфере на ацетатцеллюлозной пленке, а в качестве проявляющего буфера используют фосфатный буфер, содержащий 292,0-292,5 - 10 3М гликогена, 18-20 ° 103М аденин-5-фосфата натрия, 64-67 - 1(Г6М клюко-1,6-дифосфата, 31

33 . 103M сульфата магнезии, 80—

90 ед/л глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 40-50 ед./л фосфоглюкомутазы,, 6,4-6,6 ° 1(TЗМ никотинамиддинуклеотид- 65

19,2 10

32,7 10 фосфата (НАДФ ) натрия и 31-33 ° 10 3М этилендиаминтетрауксусной кислоты.

Образовавшийся в результате реакции никотинадениндинуклеотид проявляют в ультрафиолетовом свете.

Способ осуществляют следующим образом.

Образец гомогената наносят на ацетатцеллюлозную.пленку, которую затем помещают в электрофоретическую камеру. Электрофорез проводят при напряжении 340-360 В и силе тока 9

11 мА в течение 10-12 мин. По окончании электрофореза пленку извлекают и накладывают на другую пленку, пропитанную инкубирующим раствором, содержащим набор ферментов, НАДф и гликоген,необходимые для проведения реакции. Пленки .инкубируют при

37 С в течение 20-25 мин. Указанное время инкубации является оптимальным, так как уменьшение времени инкубации приводит к недостаточной наработке НАДН+, а увеличение не улучшает результаты. Затем пленку высушивают при той же температуре в течение 5

10 мин. Выявление фракций проводят при ультрафиолетовом освещении.

Пример 1. Ацетатцеллюлозную пленку для электрофореза Владимирского завода синтетических смол замачивают на 20-30 мин в буфере, состоящем из 1,34 г веронала, 10,3 r мединала и 5,06 r триса. Для приготовления буфера ингредиенты растворяют в дистиллированной воде при нагревании до +50 С в водяной бане и после охлаждения до +20 С доводят до объема 1 л, рН раствора 8,8, ионная сила 0,.075. Буфер используют в качестве электродного. После 25 мин выдержки, когда .пленки достаточно намокнут, на них наносят раствор исследуемого гомогената сердечной мышцы . Нанесение проводят пастеровской пипеткой с сильно оттянутым носиком. Количество наносимого гомогената около 10 мкл. Затем ломещают в электрофоретическую камеру, располагая ее таким образом, чтобы сторона, На которую нанесены образцы, была обращена вниз. Электрофореэ проводят при напряжении 350 В и силе тока 10 мА в течение 10 мин. До начала электрофореэа на другую аналогично. вымоченную в буфере пленку наносят инкубирующую смесь, которая состоит из растворов 1, 2, 3 и 4 в соотношении Я:1г0,1:1 соответственно.

Раствор 1 (моль)

Гликоген 292,4 . 10 3

Аденозин-5-монофосфат Йд

Глюкоэо-1,б-дифосфат 0,066 . 10-3

Этилендиаминаминотетрауксусная кислота (ЭДТА) 1008655

32 7 . 10 э

17 . 10 3

30 . 10

Никотинамиддинуклеотид фосфат (НАДФ)

Маа 6,55. 10

Раствор 2 (моль)

Сульфат магнезии

Раствор 3 (мкл)

Фосфоглюкомутаэа Са . (активность 200 Е/мг

2 мг (мл) 40 E) 100

Глюкозо-б-фосфатдегидрогенаэ Са (активность 350 Е/мг

5 мг (1 мл) 80 E) 50

Довести до 400 мкл 3,2 М.(МН, )250

Раствор 4 — фосфатный буфер.

КН РО 327,0

МаНРО 327,0 рН 6,8

Растворы 1, 2, 3 и 4 смешивают в следующих соотношениях: 0,3, 0,3, 0,03 и 0,3 мп соответственно. После ,тщательного перемешивания инкубационный раствор наносят на 8 мин на вымоченную ацетатцеллюлоэную пленку. По окончании электрофореэа пленки извлекают из камеры и накладывают на пленку с инкубационным раствором. Пленки прижима" ют грузом (200 r) и помещают в термостат при 37 С на 20 мин. Затем пленки разъединяют и просушивают при

37 С в течение 10 мин. Результаты электрофореза исследуют при ультрафиолетовом освещении.

На электрофореграмме сердечной мышцы отчетливо видны три изофермеи та гликогенфосфорилаэы (1 !1,111) которые можно количественно тестировать при помощи флюоресцентного денси. тометра. Общее время, необходимое на

:выполнение способа, равно 1 ч 5 мин.

Пример 2.

Способ осуществляют так же, как в .примере 1, за исключением того, что состав инкубирующей смеси следую щий (моль):.

Раствор 1 (моль)., Гликоген 29i 1 10

Аденоэин-5-монофосфат Йа2

Глюкоэо-1,б-дифосфат . 0,063 10

Этилендиаминотетрауксусиая кислота (ЭДТА)

Никотинамиддинуклеотид фосфат Ма (НАДФ) 6,3 - 10

Раствор 2 (моль)

Сульфат магнезии 31,0 . 10 э Раствор 3 {мкл)

Фосфоглюкомутаза Са (активность 200 Е/мг

2 мг (мл) 38 Е) 85

Довести до 400 мкл 3,2 М (МНУ 50

Глюкоэо-б-фосфатдегидрогеназа Са акВНИИПИ Заказ 2330/55

Филиал ППП "Патент", г. тивность 350 Е/Mr

5 мг (мл) 78 Е . 45

Раствор 4 — фосфатный буфер (моль)

КН Р04 327,0

Ма НР04 327,0. рн 6,8

Растворы смешивают в следующих соотношениях, 0,3, 0,3, 0,003 и 0,3 мл соответственно.

После проведения электрофореэа, как описано в примере 1, и окрашивания смесью приведенных растворов, 30 исследуют пленку при ультрафиолето"вом освещении.

Наблюдаем наличие темного фона и отсутствие светлых полос (фракций

15 глнкогенфосфорилаэы )

Как видно из результатов примера

2, изменение концентрации веществ в составе инкубирующей смеси приводит к невоспроизводимости способа.

Использование концентраций веществ выше, чем в примере 1, нецелесообразно, так как качество результатов то же, но удорожается процедура из.за высокой стоимости реактивов.

Предлагаемый способ по сравнению с..известным способом сепарирования гликогенфосфорилазы в геле полиакриламида обладает рядом преимуществ.

Количество реактивов, необходимое

30 для выявления иэоферментов гликогенфосфорилаэы на ацетатцеллюлозной пленке для одного образца, в 10 раэ меньше чем при работе на геле, время исследования сокращается от суток до.одного часа. Кроме того, на ацетатцеллюлозной пленке можно анализировать одновременно несколько образцов, что позволяет сравнивать их по подвижности в электрическом поле.

В отличие от известного способа, где иэоэимы идентифицируются по окрашенному раствором Люголя гликогену, 35

Тираж 871 Подписное

Ужгород,ул.Проектйая,а образовавшемуся в.результате биохимической реакции из гликогенфосфорилаэы в прецлагаемом проявляется в

45 ультрафиолете образовавшийся никотинамиддниуклеотид (НАДН)

Используемые в способе состав инкубирующей смеси и условия электрофореэа дают возможность выявлять каж=

50 дый из изоферментов отдельно с хорошей воспроизводимостью. Требуемые реактивы и-ацетатцеллюлозная пленка производятся и выпускаются отечественной промышленностью.

55 Метод изоферментного разделения гликогенфосфорилаэы исрользуют для определения иэоэимной активности гликогенфосфорилазы в сыворотке крови при инфаркте миокарда или при

0 ранней его диагностике. Способ мето,дически прост и может быть легко внедрен в клиническую: практику, а также в практику биохимических исследований.