Способ количественного определения группового состава липидов

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

РЕСПУБЛИК

09Ф (П) . го(;удАРственный комитат сссР по.делАм изОБРетений и QfHpbfAO

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ИФЕОО.ЮЭ И Е г.

6 (21) 3232049/23-04 .(22) 31.12.80 (46) 07.04.83. Вюл. Р 13 (72) С. С. Малхасьян, О. Д. Доронина, В. С. Покровский и А; П. Нечаев (71) Московский ордена Трудового

Красного Знамени технологический институт пищевой промналенности (.5 3) 543..54. 42(08ф 8) (56) 1. Hojnaeki дегоme Z. "Journal

of Chromatography". - 128, Р 1, 13 3-139 (прототип), (54) (57) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОП»

РЕДЕЛЕНИЯ ГРУППОВОГО . СОСЬВА ЛИПИДОВ . включакцций разделение смеси методом тонкослойной хроматогра4ии на еакреп ленном слое силикагелн, импрегинированном обугливакццим агентом, .нагреэа- ние с последующим денситометрирова. нием, отличающийся тем что, с целью повыаения точности анализа, в качестве обугливающего агента используют сульфат гидроксиламина, взятый.в количестве 10-15% от реса силикагеля, и нагревание ведут рри 200-210 С в течение 20-30 эвн.

1010554

Изобретение относится к способу количественного определения группового состава липидов.

Известен.спооб количественного определения нейтральных липидов после хроматографического разделения смесей липидов в тонком слое силикагеля импрегнированного обугливающим агентом - сульфатом аммония в количестве 10% от веса аммония.

Для обнаружения эон локализации липидов пластины с тонким слоем нагревают при. 187оС в течение 10 мин, при этом органические вещества обугливаются. Количественное измерение обнаруженных зон проводят путем ден- 15 ситометрирования (1).

Однако известный способ имеет недостаточную. точность количественного определения группового состава липидов, содержащих остатки насыщенных жирных кислот, вследствие малой степени обугливания их в сравнении с селективным обугливанием липидов, включающих остатки ненасыщенных жирнйх кислот. 25

Цель изобретения — повышение точности количественного группового состава липидов.

Поставленная цель достигается согласно способу количественного определения группового состава липидов, включающему разделение смеси методом тонкослойной хроматографии на закрепленном слое силикагеля, импрегнированном обугливающим агентом — сульфатом гидрбксиламина, взятым в количестве 10-15% от веса силикагеля при нагревании пластин при

200-210 С в течение 20-30 мин и последующим денситометрированием. ной камере объемом 0,5 л в вышеуказанной системе растворителей. Обнару.жение липидных зон осуществляют прогреванием пластин в термостате и последующим денситометрироэанием. Обсчет денситограмм проводят по методу внутренней нормализации. Экспериментальные данные обрабатывают по методике Евтоподента с надежностью 0,95.

Число повторностей в каждом опыте не менее пяти.

Данные количественного анализа .искусственной смеси жирных кислот и ряда ацилглицеринов убедительно иллюстрирует преимущества использования в качестве обугливающего агента сульфата гидроксиламина перед сульфатом аммония (табл.. 1, обнаружение липидных зон проводили прогреванием пластин при 210оС в течение

30 мин).

Ошибка определения насыщенных и ненасыщенных компонентов (K ) составляет 2,2-3,2%, в то время как при использовании в качестве обугливающего агента сульфата аммойия по известному способу она достигает

41,5-62,2%.

Использование предлагаемого способа обеспечивает значительное снижение различия в интенсивности обуг,ливания насыщенных и ненасыщенных соединений и повышение точности определения липидов, содержащих остатки насыщенных жирных кислот (табл.2, площадь пика линоленовой кислоты принята за 100%)., Подобный сравнительный анализ промышленных липидных смесей (под солнечное масло и пальмовый стеарин) показали, что если при количественíом определении липидов, содержащих высокий Ъ ненасыщенных жирных кислот (подсолнечное масло), не наблюдает:ся существенных различий по предлагаемому и известному способам, то в случае высоконасыщенного масла использование сульфата аммония в качестве обугливающего агента непригодно иэ-эа значительных расхождений (табл. 3) .

Способ осуществляется следующим образом.

Искусственные или природные смеси липидов подвергают хроматографи- 45 ческому разделению: на стеклянных пластинах размером.25х75 мм с закрепленным слоем силикагеля, содержащим сульфат гидроксиламина. Для приготовления пластин суспензию из

1,050 r сoи лnиHкKа г еeлnя, 0,105 г гипса и сульфата гидроксиламина в 7,5 мл дистиллированной воды разливают на

10 пластин по 0,75 мл, сушат при комнатной температуре и затем активируют при 110 С в течение часа.

Пластины хранят в эксикаторе над хлоридом кальция. Перед нанесением образца пластины чистят в системе растворителей гексан : диэтиловый эфир t уксусная кислота (50:10:1). Для про- 60 ведения хроматографического разделения на пластину наносят 1 мкл 23% раствора, смеси липидов в хлороформе

:и проводят хроматографическое разделение восходящим методом в стеклян- 65

В табл. 3 приведены результаты определения содержания триглицеридов денситометрическим методом.

Сравнительный анализ количественного состава природных липидов (дрожжевые микроорганизмы) по предлагаемому способу, весовым методом и с применением сульфата аммония в качестве обугливающего агента (табл. Р 4) показывает, что предлагаемый способ обеспечивает большее совпадение с весовым способом, нежели известный.

В табл. 4 приведены результаты количественного определения группового состава липидов дрожжей.

1010554 в 7-18 раз.

Приведенные выше данные показывают, что предлагаемый способ обеспечивает значительное увеличение точности количественного анализа (от 5,9 до 41,5%) липидов, содержащих остатки насыщенных жирных кислот (три-, ди- и моно- ацилглицерины, фосфатидилхолин) вследствие того, что он позволяет избежать селективного обугливания липидов с ненасыщенными жирными кислотами.

Пример 1. Пластины, приготовленные как указано выше, прогревают при 190, 200; 210 и 220 С. Интенсивность пятна маргариновой кислоты (С а. ), определенная на денситометре относительно интенсивности пятна линоленовой кислоты С з), приведена .в .табл. 5 (отношение площадей

Сл. О пиков

4S Ú

Пример 2 ° Приготовление пластинок с закрепленным слоем силикагеля, импрегнированного 10% сульфата гидроксиламина.

Для приготовления 10 пластинок к силикагелю (1,050 r) и гипсу (0,105 г) приливают раствор .0,105 г сульфата гидроксиламина в 7,5 мл дистиллированной водой и-тщательно пЕремешивают. На одну пластинку наносят 0,75 мл суспензии. Пластинки сушат при комнатной температуре и затем активируют при 110 С в течение часа. На пластинку наносят 1 мкл .2%-го раствора кислоты (0,02 мг) в хлороформе и хроматографировании, как описано выше. Обнаружение кислот осуществляют, прогревая пластинки в термостате при 210 С в течение

30 мин с последующим денситометрированием.

Пример 3. Приготовление пластинок с закрепленным слоем силикагеля, импрегнированного 5% сульфата гидроксиламина.

Для приготовления 10 пластинок

;к. силикагелю (1,050 r) и гипсу (0,105 г) приливают раствор 0,0525 r сульфата гидроксиламина в 7,5 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. На одну пластинку наносят

0,75 мл суснензии. Подготовку пластинок, нанесение образцов, проявление хроматограмм и обнаружение проводят как указано в примере 2.

Пример 4. Приготовление пластинок с закрепленным слоем силикагеля, импрегнированного 20% сульфата гидроксиламина. Для приготовления 10 пластинок к силикагелю (1,050 r) и гипсу (0,105 г) приливали раствор 0,21 г сульфата гидроксиламина в 7,5 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. На одну пластинку наносили 0,75 мл суспензии. Подготовку пластинок, нанеение образ ов,-проявление хроматограмм и обнаружение проводят, как указано в примере 2.

Результаты, полученные по примерам 2-4, приведены в табл. б.

Из данных, представленных в табл. 6 следует, что наиболее оптимальная концентрация импрегнирующего агента 10-15%. При более ниэком содержании сульфата гидроксиламина

10 (например, 5%) увеличивается различие в интенсивности обугливания насыще ной С„-,-„ и ненасыщенной С З кислот. При увеличении концентрации импрегнирующего агента (иапример, 20%) 5 интенсивность обугливания кислот не изменяется, но в связи с потемнением фона пластинки экстинкция зон уменьшается, что неблагоприятно сказывается на точности анализа.

20 Пример 5. Пластины, приго-Ф товленные, как указано вжае, прогре.вались при 210ОС в течение 10-40 мии.

Интенсивности пятна маргариновой кислоты относительно интенсивности

25 пятна линоленовой кислоты приведены в табл. 7.

Как следует из данных, предстагленных в табл. 7, наиболее оптимальным является время прогрева, равное

20-30 мин. При уменьшении времени прогрева (например., 10 мнн) значительно возрастает разница площадей пиков насыщенной и ненасыщенной кислот. При увеличении времени прогрева (например, 40.мин) происходит, по-видимому, деструкция линоленовой кислоты, что приводит к снижейию точности анализа.

Данные по влиянию соотношения насыщенных и ненасыщенных соединений

40 в группе на определение данной группы липидов на хроматограммах. Сравнительные данные, полученные по предлагаемому способу и способу-прототипу, приведены,в табл. 8 приведены

45 средние значения не менее пяти параллельных измерений).

Во всех случаях площадь пика ненасыщенного соединения принималась за 100%, влияние доли насыщенных. соединений на обнаружение определяли как разность между показаниями (выраженными в процентах) ненасыщен« ного соединения и соответствующей смеси (Ь и hg ). Отношение этих величин (д /a< ) показывает, что ошибка при определении на хроматограммах смесей, содержащих более

20% насыщенных соединений по предлагаемому способу в 1,2-9,2 раза меньше, чем по известному, при увеличе60 нии содержания ненасыщенных соединений в смеси эта величина возрастает и точность определения по предлагаемому способу превыаает точность определения по известному способу

1010554

Таблица 1

Компонент смеси .

Содержание (% от суммы) . Найдено Относнтель(% от ная ошибка, суммы) %

Найдено Относитель(% от ная ошибка, суммы) %, 38,7 3,2 64,9 62,2

40,0

Триолеин

Маргариновая кислота

Дипальмитин

23,6

22,1

20,0

20,0

18,0

10 5

12,9

11,6

35,5

42,0

Моностеарин

20,0

15,6

22,0

10, 6

47,0

X насыщенных компонентов

60,0

61 3

2,2

35 1

41,5

Х ненасыщенных компонентов

40,0

38,7

3,2

64,9

62 2

+A - силикагель содержал 15% сульфата гидроксиламина, ф

В - силикагель содержал 15% сульфата аммония .

Таблица 2.

Известный способ

Предлагаемый способ

Анализируемые липиды

Относитель- Площадь Относительная площадь пика, ная площадь ,пиков, % мм пиков, .%

Площадь пика, Относитель мм ная погреш ность, %

700,2 86,6! 93,5

4, 47

Фосфатидилхолин 431, 2+19, 3

Дигалактозилдиглицерид

868,4 . 107,4

103,1

1,60

475,5+7,7

437,2+18,7

492,4

60,9

94,8

3,9

Моностеарин

494,9,61,2

95,6

3,74

2,70

440,9+16,5

Дипальмитин

97, 9

451,5+12,2

108,1

110;4

3,02

498,5+15,1

509,2+13,5

2,66

Маргариновая кислота

95,2

439,0+16,6

503,7 62,3

3,78

Линоленовая кислота

100,0

100,0

2,91

60,8

94,6

3,88

101,2

99,7

3,11

890,3 110,1

103,7

100,3

478,3+15,5

3,24

2,54

514,3

63,6

462,6+11,8

101,9

Холестеролпальмитат

851,4 105,3

2,40

470,0+11,3

Диолеин

Холестерин

Эргостерин

Трипальмити,н

Триолеин

Метилолеат

Этилстеарат

461,2+13,4

436,3+16,7

459,8+14,3

805,4

912,9

943,6

808,6

491,6

818,3,99,6

112,9

116,7

1010554

% 1

РЪ мбит !

«" (р °

1О

С Ъ

ОЪ (СЧ С» С Ъ с «с ч .н

CO ОО CO

К) Ф CO с с

Ch «Ф «-б

CO Oi

ССЪ

° с

CO (»

C) с

«.(С Ъ с с ° с

\О aA с Ъ

° У «3 «О"

Оа ъО с с (»

« У «б

Cl с

С ) аА

° с

СО (»

° Э «Ф с

+ с

СО

СЧ с

73

CO с

ОО

СЧ «й

«-(Ю

EO Ю

ОО ОЪ с с а о

aA . aO

_#_

g а

Щ ф

3«. с

О CO

С»

Й

CV

9 с о

Ф

Э

5 о

«Ф

« с (CO в о с с

СЧ Ch

С» (»

«" «С Ъ с с

° О ОО

СО СО

«

СЧ

ОЪ о

СЧ с

° Ф

+!

ЧЭ с

Ю («

\D «С с

ОЪ !» ((» аА .«С . с с о

СО с

СЧ 1

+! 1

СЧ. 1 с

С«Ъ иЪ 3

1

РЪ с

С"Ъ

+I

СЧ с (»

ОО о с

OО ао

° Ф (с с о

СО ОЪ

«У с (CO

%-(I ф

СЧ ОЪ 3 . ССЪ Ф 8 1

1 1 1 1

1. I и

1 (а 0 б

1 1 («б

0(! -!

1 1 Ф (a( (xO I ! ИЦ!

1 0(L 1

1 K O I (ае!

I,1 ФЦ ! 1 ЦЯ I оц(! О4

1 .ЕС

1 l 4 I

I 3 I Е I

М 1 ! 1 а

1 13 0(( (e I O(1 Ol ЯЦ!

I U 1 Ж и 1 (o(оа!

1 L 1 (09 (o(ц (OgI (Ф!9(«(121(О41

I Е 1 1

1 9 Ь- — -1 ! 0(I I

1 41 3 I.

1 Ф I g l (и(о

I Ц I.Ж 4 I

l Э(9X I

1 а(Ц 1 с ! О4! ! Фо! ((О((l 1 .I a1

1 I 1

I I 1 I

I 1 и I

1 1 аco 1. о

I 1 (« I

1 1 9(01 (LOI ! I ЖЦ!

1 1 6(g 1

I 1 (a(а.! (ае!

1 ЭЦ!

I I ЦМ!

O@I

О 41

1 1

1юс (о! и (o» z(1 (1 Ж I (о! а-!

I I 3«(((I (О((О!

31 ЯЦ(I L!L L 1 !.3 (оа! ! О! СОЕ( (Ф I QI (О((ОМ(I.(01 94 I

I X I g(3 C (— 1 (I I б I L I о ! 1 Ф ! I X)I (Ц.

I I l

3 C

I 3 9 I о

1 1 (a(1 а!

11941

1!ФОI

1 I ((31« I

1-3

I (1 I с l ! а 1

I О I ! о

1 I

1 % I

СЧ \O С"Ъ ((с с с с с ° С

ОО «э aA «P

МЪ aA an aA an

МЪ «1 Ю с с ° с. с

Ch Ch Ю «( С«Ъ И «0 «Ф О ««саа сч с с с

О 3 С"Ъ" с(с

an. an aA aA «О аА

«С I с н

+1 I н с

СО 1

1

1

Ch, 1 о с ) +I иЪ с

an I

«Ф 1

1

I l

СЧ 1 °

СЧ 1

-+t I ..

«-(с аО

an 1

1

1

I с сС 1

+1 1

СЧ I с

ИЪ

С»

1

1."О с а 1

+4 I о (с

О I

I I

1010554

Таблица

Рруппы липидов

Весовой метод, % от суммы

27,0+1,0

11,0+0,6

11(1+1(1

12,2 0,5

38(7+2(0

41,2+1,2

Таблица 5

Температура, С (Обугливающий агент

95,0 118,6

Сульфат гидроксиламина

Сульфат аммония

91,7

85,6

Таблица 6

Площадь пика маргариновой кислоты С ., 1:о) Относительная площадь .пиков

С ;о

49:Ъ

Площадь пика. линоленовой кислоты С„ .. 1

85,8

83,1

95,0.

20

94,7

Таблица 7

Отношение площадей пиков Сд: о..

Площадь пика

Время прогрева, мин линоленовой кислоты

С9 ., мм маргариновой кислоты

С,:о

83,4

319,3

421,9

20

93,6

95,0

437,6

109,8

422,9

385(1

Полярные

Ди глицериды

Жирные кислоты

Триглицериды

Эфиры стеаринов

Количество импрегнирующеro агента, Ъ от массы силикагеля

29,0ф1,6

11,9+1,6

12,0+1,5

12,5+1,5

34,2+1,5

398,7

449,3

460,8

437,2

382,9

450,7

460,8

Известный способ Предлагаемый способ, % от сумьы Ъ от сумки

32,8+1,6

8,8+0,5

8,4+0,4

9, 3+0,6

190 . " 200 210 220

46,9 55,5 61,5 82,4

341,7 418,3

437,8

414,0

1010554

Таблица 8

Содержание насыщенного соединения, -Ф

Соотношение насыщенных и ненасыщенных соединений, Ъ г

Известный способ Предлагаемый способ

0 (диолеин) О

0,6

99,4

10 3,7

9,2

99,6

98,2

22,4

12,4

98,0 2,0

67,1 32,9

60 16,4

63,4 36,6

2,0

98,0

1.8, 3

97,8

17,5

61,5 38,5

100 (дипальмитин) 2 2

100,0 0

О (триолеин) О

100,0

99,6 0,4

0,4

99,6

10 1,2

1у9

2,2

98,1

97,8

40.96,7

3,3

6 0

19,9

80,1

34 0 96 0

4,0

8,5

66,0

60,5 39,5

95,1

4,9

41,1

59,9

5,4

100 (трипальмитин) Смесь этиллинолеат:этилпальмитат

100,0 О

0 (этиллинолеат) О

100,0

10

1,3

0,3

40

1,7

5,4

98,3

9,2

9,3

2,4

97;6

22,4

80

96,4

36 . 91

32,8

67,2

8,8

4р2

95,8

100 (этилпальмнтат) 37,0

63,0

Составитель В. Гбрленко

Редактор В. Пилипенко Техред A.Âàáèíåö

Корректор М. Марсши

Заказ 2480/34 Тираж 871

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Рауюская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Смесь диолеин:диапальмитин

100,0 0

96,3

77,6

Смесь триоленн:трипальмитин

99,9 0,1

99,6 0,4

90,8

77,6

100 i0

100,0

100i0

99,7

0,4

1;8

Точность определения

А„./b, 8,1.

7,6