Способ изоэлектрического фокусирования белков

 

(19) (11) СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

g g G 01 1ч 33, 50.ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ CCCP (21) 3275080/28-13 ..(22) 09.02.81

:(46) 07.04.83. Бкп. М 13 (72) Г. Ю. Ажицкий, Г. В. Троицкий . и Л. Н. Хирсв (71) Крымский медицинский институт (53) 616.07 (088.8) .(56). 1. Приборы для биохимии и ничвского анализа. Стою.ольм, изд-во .nAccenten Rek1am and Тт ус1с АВ", 1975, :.с . 60-61.

2. Ажицкий Г. Ю., Троицкий Г. B.

Изоэлектрическое фокусирование в искус.ственном градиенте рН. — в кн.: Элек.трофоремические методы анализа белков, . "Наука, СО АН СССР, Новосибирск, 1981, с. 23-32.

:(54) (57) СПОСОБ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО

ФОКУСИРОВАНИЯ БЕЛКОВ включакеций создание устойчивого градиента рН внесением раствора сахарозы в трис-берат иый буфер в изоэлектрической колонке, отличающийся тем, что, с целью возможности фракционирования белков с изоэлектрическимн точками в диапазоне рН 9,3-12,0, градиент рН создают путем многократного последовательного внесения в колонку раствора свхарозы, при первоначальной концентрации сахарозы 64-65 % с последую тцим уменьшением ее на 3-4 7 при каждом внесении, при этом используют

0,001-0,0015 М трнс-боратный буфер, содержаший 0,007 0,0075 М едкого натра.

1010563

10 !

40

55

Изобретение относится к биохимии и биофизике, в частности к способам электрофореза белков в искусственных градиентах рН.

Известен способ изоэлектрического фокусирования белков путем создания устойчивого градиента рН с помошью буферного раствора .— вмфолина. Этот раствор состоит из веществ пептидной природы (более 1000 компонентов) с различной величиной Р3. Будучи внесенными в электрическое поле, амфолины двигаются к аноду и катоду и таким образом создак г градиент рН в диапазоне 9-11 L 1j

Недостатком этого способа является

О невозможность получения градиентов рН более 11. Это препятствует фракционированию крайне. щелочных белков, таких как гистоны, цитохромы; и ферментов, например липогенвзы.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ изоэлектрического фокусирования белков, включающий создание устойчивого грвдивнта рН внесением раствора свхврозы в трио-борвтный буфер в изоэлектрической колонке j2)

Однако известным способом возможно получать градиент рН в трис-боратном буфере (рН 8,5) только в интервале

4,5-8,5, что не позволяет фрвкционировать белки и ферменты, имекнцие изоэлектрические точки (P3 ) в диапазоне рН 8,5 — 12.

Бель изобретения — возможность фрак- ционирования белков с изоэлектрическими точками в диапазоне рН 9,3-12,0.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу изоэлектрического фокусирования белков, включаклцему создание устойчивого градиента рН внесением раствора сахарозы в трис-боратный буфер в изоэлектрической колонке, градиент рН создают путем многократного последовательного внесения в колонку раствора свхарозы, при первоначальной концентрации сахврозы 64-65% с послеI дующим уменьшением ее на 3-4% при каждом внесении, при этом используют

0,0015 М 015 М трис-борвтный буфер, содержащий 0,007-0,0075 M едкого патра.

Способ осуществляют следующим образом.

Гиговят два раствора. Первый (А) состоит из 0,00125 M (0,00100,0015) М буры; 0,00125 М (0,0010-0,0015) М три (гидроксиметил) аминометинв и 0,00725 (0,00700,0075) М едкого нвтра. Второй раствор (B) состоит из раствора А, в которой доплнительно вносят сахарозу до концентрвции 64,5% (64-65%), и для получения градиента рН растворы А и В смешивают, т.е. понижают концентрацию свхаро-. зы до необходимой. QaIIee порции раствора (смесь А и B) вносят в изоэлектрофокусируюшую колонку, куда помешают анализируемую пробу белка. Верхний и нижний электролитные сосуды заполняют раствором А и подключая электрический ток проводят изоэлектрическое г фракционирование белка. .Пример . Готовят раствор, содержащий 0,00125, М буры, 0,00125М триса и 0,00725 М едкого патра, а также раствор, содержащий все перечисленные компоненты в той же концентрации и дополнительно 64,5% сахарозы.

Для получения градиента рН в интервале 9,3-12,0 в 20-ти пробирках смешиBaIoT трис-боратный буфер с тем же буфером, содержащим 64,5 % сахарозы, причем смешивают в такой пропорции, чтобы концентрация сахарозы в каждой последукяцей пробирке уменьшалась на 3,0% в интервале концентрации сахарозы 64,5% - 0,5%. Затем в иэофокусируюшую колонку вносят 2,5 мп трисборатного буфера с.свхарозой из первой пробирки, т.е. с концентрацией сахароэы

64,5%, затем по 2,5 мл из каждой последукяцей пробирки: 2-ой, 3-eR и т.д. до 15-ой, после чего вносят 2,5 мл цитохрома С, растворенного в 16-ой порции градиента рН и по 2,5 мп 17-ой, 18-ой, 19-ой и 20-ой порции. Верхний и нижний электродные сосуды заполняют буферным раствором А, состав которого:

0,00125 М буры,. 0,00125 М триса и 0,00725 М едкого натра.

Концентрация сахарозы и рН в каждой порции градиента приведены в таблице (стабильный градиент рН в диапазоне рН 9,3 - 12,0).

Условия опыта: напряжение 1250 В, 21 В/cM, ток 4,5 мА. Время фокусирования 21,5 ч. После проведения изофокусирования содержимое колонки элюируется через проточный денситометр РЭППС-1 М на автоматический коллектор. Измерение рН, проведенное в каждой пробе, покаэывает, что градиент рН практически не искажается за время изофокусирования, и находится в пределах рН 9,25-9,351 10563 4 е.т расширение градиента рН до 12,0,,позволяет производить иэофокусирование белков в диапазоне 9,3-12,0, который ранее не был доступен. &то дает воэs можность производить высокоэффективное фракционирование и очистку уже известных белков, изоточки ксторых находят- ся в этом диапазоне, а также осешуп вить поиск не известных ранее белков.

64;5

9,30

58,5

9,45

9,55

55,5

9,70

52,5

49-50

49,5

9,85 9, 80-9,90

9,95-10,05

10,05-1 О, 1 5.

1 0,20-10,30

10,00

10,10

45-46

45,5

41- 42

41,5

l0,25 .

3 7-38

33-34

29-30

37,5

33,5

10,35-10,45

10,40

10,55

10,50-10,60

29,5

25-26

10,65-10,75.

10,70

25,5

22,5

10,80-10,90

22-23

19-20

10,95-1 1,05

11,05-11,15

1 1,20-1 1,30

1 1,35-1 1,45

l5-16

15,5

11-12

11,5

8,5

16

11,50-1 1,60

6-7

6,5.17

3-4

1 1,65-1 1,75

3,5

11,85 11,80-11,90

2-3

2,5

1 1,95-12,05

12,00

0,5

ВНИИПИ Заказ 2482/35 Т аж 871 Подписное

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

11,5-12,5. При анализе распределения белка получено, что изоэлектрический спектр цитохрома С состоит иэ трех ковшонентов с иэоточками 10,5 (основной компонент) 9,8-9,9 и 11,1-11,2 (минорные компоненты) .

Таким образом, предлагаемый способ ,по сравнению с известным обеспечива64-65

58-59

55-56

52-53

10,85

11,00

11,10

11,25

11,40

11,55

1 1,70

9,25-9,35

9,4-9,5

9,5-9,6

9,65-9,75